$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
- Fazer agulhas de vidro antes da cirurgia mouse:
- Coloque o tubo de vidro capilar em um extrator de micropipeta.
- O calor do meio do tubo de vidro para suavizar o tubo de vidro na área localizada.
- Estique o tubo de vidro ao longo de seu eixo longitudinal por uma distância inicial suficiente para causar uma redução no diâmetro do tubo de vidro na área localizada.
- Mantenha o tubo de vidro que se estende até que quebre. Desta forma, dois idênticos agulhas único barril são obtidos.
- Coloque a agulha de vidro em uma microforge. Um ângulo de 30 ° é suficiente para chanfrar a ponta.
- Verifique sob o microscópio que cada agulha tem o diâmetro correto interior. Para a maioria das drogas hidrofílicas um diâmetro 30-50 mM interior é ideal (figura 1).
- Encha-se a agulha com óleo mineral a partir da maior final de agulha de vidro. Deixe que o óleo mineral (MSDS, Cat. M7700) entra por capilaridade, até atingir ~ 50% do comprimento do tubo capilar. Coloque a vácuo de alta gordura (Dow Corning, Cat. 05054-AB) em todo o êmbolo para selar o maior ponta da agulha.
- Insira o êmbolo pelo maior ponta da agulha e empurre delicadamente o óleo mineral até que uma pequena gota de óleo é visto saindo da ponta da agulha de vidro.
- Segura a agulha de vidro no suporte do microinjetor.
- Anestesiar o rato com Avertin 2,5% (2,2,2-tribromoetanol + terc-amil álcool, 01:01 w / v). Dose de 25 30μL por grama intraperitoneal.
- Coloque uma almofada de aquecimento no aparelho estereotáxico para manter a temperatura corporal do animal a 37 ° C.
- Lugar e segura a cabeça do rato no dispositivo estereotáxico usando barras de ouvido e um suporte de dentes.
- Limpe a cabeça do rato com a solução de gluconato de clorexidina 0,1%, seguido por etanol 70% e gluconato de clorexidina 0,1% pela segunda vez.
- Inciso a pele com uma lâmina cirúrgica # 15 de orelhas de rato para a linha do crânio Lamba.
- Polonês do crânio com um cotonete para secar o produto e puxar a pele para fora do campo cirúrgico.
- Use a ponta da agulha de vidro para apontar para o vértice da sutura bregma. Lá você tem que definir a posição inicial do injetor (a coordenada "zero").
- Definir o ponto a ser perfurado, movendo o "X" e "Y" eixo do dispositivo estereotáxico sobre o crânio.
- Broca com muito cuidado buracos na coordenada selecionada. Microdrills e ferramentas de outros metais foram previamente esterilizado a 250 ° C por 60 segundos com um pano seco de contas de vidro esterilizador (Cole Palmer, Cat. No. EW-10779-00).
- Com uma pinça fina remover com cuidado a camada mais profunda do osso e romper a membrana duramatter (você vai ver algum fluido cérebro-espinhal vazando).
- Confirmar que a agulha pode passar por buracos perfurados.
- Pipetar 1 mL da droga você quer injetar e colocá-lo em um pequeno pedaço de parafilme.
- Coloque o parafilme sobre o crânio.
- Sugam a droga girando a roda microinjetor, enquanto verifica sob o microscópio que o fluido está subindo para dentro da agulha de vidro.
- Remover o parafilme e re-definir a coordenar zero.
- Mover a agulha para as coordenadas selecionado, o porta até que a ponta da agulha de vidro tocar suavemente na superfície do cérebro e definir a "Z" coordenar a zero.
- Introduzir a agulha de vidro para o parênquima cerebral em profundidade selecionada.
- Injetar a droga lentamente a uma taxa de ~ 1 nl / sec.
- Quando o volume desejo é injetado, deixe o difuso de drogas dentro do parênquima por 2 min. Em seguida, avance para remover a agulha suavemente e lentamente.
- Cola a ferida cirúrgica e remover o animal a partir do dispositivo estereotáxico e colocar o animal em uma gaiola pré-aquecido contendo uma cama limpa para a recuperação da anestesia.
- Para fornecer analgesia pós-operatória todos os animais receberam 5 mg / kg subcutânea Ketorolac cada hora de 12 para 24 h.
Resultados representativos:
Ao seguir este protocolo, uma injeção muito precisa é obtida e uma faixa muito estreita agulha minimiza lesão cerebral. Como resultado representante deste método, injetamos lysophosphatidyl colina (lysolecithin) no corpo caloso, que produz desmielinização de tratos de substância branca 1-4. Para minimizar a lesão cerebral produzido pela agulha de vidro, injetou apenas 20 nl de lysolecithin no corpo caloso, mas se necessário maior volume de até 200 nl pode ser injetado com o mesmo método. Desmielinização é detectada pela ausência de mielina expressão da proteína básica na tratos de substância branca (Figura 2).
Figura 1. Uma agulha de vidro com um diâmetro de 50 mícrons. Distância entre dois ticks curtana escala representa um comprimento de 50 mícrons.
Figura injeção Lysolecithin 2. No corpo caloso. Desmielinização é mostrado como um não a expressão da proteína básica de mielina (área pontilhada). Observe o pequeno tamanho do vidro do trato agulha (setas). Bar = 100 mm