RhoC Assay Activation GTPase

Resumo

Este protocolo utiliza um pull down ensaio para determinar os níveis de GTPase RhoC ativa dentro das células.

Resumo

RhoC GTPase tem homologia de 91% para RhoA GTPase. Devido à sua prevalência nas células, muitos reagentes e técnicas para RhoA GTPase têm sido desenvolvidos. No entanto, RhoC GTPase é expressa em células de câncer metastático em níveis relativamente baixos. Por isso, poucos RhoC-reagentes específicos têm sido desenvolvidos. Nós adaptamos um ensaio de ativação Rho GTPase para detectar RhoC. Esta técnica utiliza um GST-Rho proteína de fusão de ligação de domínio para retirar GTPase RhoC ativo. Além disso, podemos colheita de proteína total no início do ensaio para determinar os níveis do total (GTP e GDP bound) GTPase RhoC. Isso permite a determinação da ativa versus total de GTPase RhoC na célula. Várias versões comerciais deste procedimento têm sido desenvolvidos no entanto, os kits comerciais são otimizados para RhoA GTPase e, normalmente, não funcionam bem para RhoC GTPase. Partes do ensaio ter sido modificado, bem como o desenvolvimento de um anticorpo específico RhoC.

Protocolo

1. Prepare proteína de fusão GST-

1. Stocks de glicerol JM109 bactérias competente, que contenha o primeiro N-terminal 90 aminoácidos da Rho rhotekin ligação de domínio (RBD) subclonado no pGEX3x BamH1/EcoR1 vector são feitas.
   
   Para garantir alta eficiência Os seguintes passos devem ser realizados para cada experimento. Em nossa experiência, preparados na hora GST-RBD é a chave para um ensaio robustas e precisas GTPase ativação.
2. Adicionar 50 mL (aproximados, não descongelar) do estoque de glicerol a 50 mL de LB ampères e crescer 37 ° C durante a noite com agitação.
3. Diluir 1:10 em 500 mL LB-amp e crescer por 1 h.
4. GST induz....

Discussão

A etapa mais crítica do procedimento é a geração de novos GST-RBD. Incapacidade de prestar muita atenção para esta etapa é principal razão para o fracasso. Todas as etapas, desde a geração do GST-RBD (1,2) para a incubação durante a noite com o lisado celular (2,5), deve ser feito em um único dia. Outro passo fundamental é a certeza de que existem células suficientes para produzir os lisados ​​celulares. Isto é de particular importância quando se olha para RhoC GTPase, que tende a estar presente em níveis baixos na célu.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Grânulos de glutiona-sepharose 4B	GE Healthcare	17-0756-01
Criterion 4-20% Tris-HCl géis	Bio-Rad	345-0032