Um ensaio para medir a atividade do Escherichia coli Induzível Lisina Decarboxyase

Resumo

A atividade da descarboxilase induzível lisina é monitorado pela reação do substrato L-lisina e cadaverina o produto com 2,4,6 trinitrobenzensulfonic-ácido para formar adutos que têm solubilidade diferencial em tolueno.

Resumo

A Escherichia coli é uma bactéria entérica que é capaz de crescer em uma ampla faixa de valores de pH (pH 5-9) ¹ e, incrivelmente, é capaz de sobreviver ácido extremo frisa, incluindo a passagem pelo estômago de mamíferos, onde o pH pode cair para valores tão baixos como pH 1 - ² 2. Para habilitar a um leque tão amplo de sobrevivência pH ácido, E. coli possui quatro diferentes induzível decarboxylases aminoácido que decarboxylate ácidos seu substrato aminoácidos de uma maneira próton-dependentes elevando o pH interno. O decarboxylases incluem o ácido glutâmico decarboxylases Gada e GadB ^3, a arginina descarboxilase Adia ^4, a lisina descarboxilase LdcI ^{5, 6} e ornitina decarboxilase SpeF ^7. Todas essas enzimas utilizam piridoxal-5'-fosfato como um co-fator ⁸ e funcionam em conjunto com a membrana interna-substrato-produto antiporters que remover produtos descarboxilação ao meio externo, em troca de substrato fresco ^2. No caso de LdcI, o antiporter lisina cadaverina é chamado CADB. Recentemente, nós determinamos a estrutura de cristal de raios-X de LdcI a 2,0 Å, e nós descobrimos um romance de pequenas moléculas obrigado a LdcI o regulador de guanosina 5'-difosfato rigorosos resposta, difosfato-3'(ppGpp) ^14. A resposta severas ocorre quando as células em crescimento exponencial experiência de privação de nutrientes ou uma de uma série de outros estresses ^9. Como resultado, as células produzem ppGpp que leva a uma cascata de sinalização que culminou com a mudança de crescimento exponencial para o crescimento da fase estacionária ^10. Nós demonstramos que ppGpp é um inibidor específico da LdcI ^14. Aqui nós descrevemos o ensaio descarboxilase lisina, modificado a partir do ensaio desenvolvido por Phan et al. ^11, que temos usado para determinar a atividade de LdcI eo efeito de pppGpp / ppGpp essa actividade. A reação de descarboxilação LdcI remove o grupo α-carboxila de L-lisina e produz dióxido de carbono ea cadaverina poliamina (1,5-diaminopentane) ^5. L-lisina e cadaverina pode ser reagido com ácido 2,4,6-trinitrobenzensulfonic (TNBS) em pH elevado para gerar N, N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverina) e N, N'-bistrinitrophenyllysine (TNP-lisina), respectivamente ^11. O TNP-cadaverina podem ser separados do TNP-lisina como o primeiro é solúvel em solventes orgânicos como o tolueno, enquanto o último não é (ver Figura 1). A faixa linear do ensaio foi determinada empiricamente usando purificada cadaverina.

Protocolo

1) Reagentes e Equipamentos

1. Primeiro, prepare as três seguintes soluções: 1 mL de uma solução que é composta de 8 mM L-lisina, 100 mM de sódio 2 - (N-Morfolino) ethanesulphonic ácido (MES) pH 6,5, 0,2 mM de nucleotídeos, onde o nucleotídeo é ou: difosfato de guanosina (GDP), o trifosfato de guanosina (GTP), guanosina 5'-difosfato, difosfato-3'(ppGpp), ou guanosina 5'-trifosfato, difosfato-3'(pppGpp), 0,1 mM piridoxal-5'-fosfato (PLP), e 1 mM β-mercaptoetanol / (β-ME). 1 mL da solução B, que consiste em sódio 100 mM MES pH 6,5, 0,1 mM PLP, 1 mM β-ME, e 50 nM LdcI. LdcI foi purificada como descrito no Snider et al. ⁶ e Kanjee et al.

Discussão

No ensaio descarboxilase lisina, TNBS é reagido com as aminas primárias de L-lisina e cadaverina para formar TNP-lisina e cadaverina TNP-adutos (Figura 1). Devido à presença do grupo de ácido carboxílico em TNP-lisina, este permanece aduto solúvel em água, enquanto o TNP-cadaverina, faltando o grupo ácido carboxílico, é capaz de particionamento em tolueno ^11. Este tipo de ensaio pode ser utilizado de forma mais ampla em outros tipos de aminoácidos, onde a perda de um grupo de ácido carboxílico ocorre durante .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ácido 2,4,6-trinitrobenzenossulfônico	Sigma-Aldrich	P2297
0,1 mM piridoxal 5’-fosfato (PLP)	Sigma-Aldrich	P9255
Cadaverina	Sigma-Aldrich	D22606
Placas de poliestireno de 96 poços	Sarstedt Ltd
Placa de quartzo de 96 poços	Hellma
Bloco térmico digital VWR	VWR international
ThermoStat Plus	Eppendorf
Placas de polipropileno de 96 poços de 2,0 mL	Axygen Scientific	P-DW-20-C
Pipetador repetidor Handy Step	Brand GmbH
Pontas de pipetador repetidor de 12,5 mL	Brand GmbH	702378
Leitor de placas SpectraMax 340PC	SpectraMax