Edição de genes mediada por transposon PiggyBac em iPSCs humanas: um procedimento para integrar gene de interesse em iPSCs humanas usando o sistema de transposon PiggyBac

Published: April 30, 2023
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Abstract

Fonte: Garone, M. G. et al. Conversão de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs) em neurônios motores espinhais e cranianos funcionais usando vetores PiggyBac. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra o procedimento para gerar neurônios motores por transfecção de iPSCs humanas com sistema de transposons PiggyBac pela expressão ectópica de fatores de transcrição específicos da linhagem.

Protocol

1. Geração de linhas iPSC induzíveis por NIL e NIP

  1. Transfecção celular
    1. Enxágue as células com PBS (livre de Ca2+/Mg2+).
    2. Adicionar o reagente de dissociação celular (ver Tabela de Materiais) (0,35 ml para uma placa de 35 mm) e incubar a 37 °C até que as células individuais sejam
    3. separado (5-10 min).
    4. Complete suavemente a separação celular pipetando para cima e para baixo com um pipetador P1000 3-4 vezes.
    5. Colete em um tubo de 15 mL e adicione PBS (Ca2+/Mg2+ livre) a 10 mL. Conte as células.
    6. Pellet 106 células e ressuspender em 100 μl de tampão R (incluído no kit de eletroporação de células, consulte a Tabela de Materiais).
    7. Adicionar DNA plasmidial para transfecção: 4,5 μg de vetor transponível (epB-Bsd-TT-NIL ou epB-Bsd-TT-NIP) e 0,5 μg do plasmídeo piggyBac transposase.
    8. Transfect com o sistema de eletroporação de células (ver Tabela de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante com os seguintes parâmetros: tensão de 1.200 V, largura de 30 ms, 1 pulso. Semeie as células em meio iPSC humano suplementado com 10 μM de Y-27632 (inibidor de ROCK, consulte Tabela de Materiais) em um prato revestido com matriz de 6 mm.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

B27Miltenyi Biotec 130-093-566Serum free supplement for neuronal cell maintenance
BambankerNippon GeneticsNGE-BB02Cell freezing medium for motor neuron progenitors
CaCl<sub>2</sub>Sigma-AldrichC3881Chemicals for electrophysiological solutions
Corning Matrigel hESC-qualified MatrixCorning354277Reconstituted basement membrane preparation from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma. Used for adhesion of iPSC to plastic and glass supports
CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIABiological Industries05-710-1EFreezing medium for human iPSCs
DispaseGibco17105-041Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
DMEM/F12Sigma-AldrichD6421-500MLBasal medium for cell culture
DoxycyclineSigma-AldrichD9891-1GUsed to induce expression of transgenes from epB-Bsd-TT-NIL and epB-Bsd-TT-NIP vectors
DS2UWiCellUWWC1-DS2UCommercial human iPSC line
GDNFPreproTech450-10Glial-Derived Neurotrophic Factor
Gibco Episomal hiPSC LineThermo Fisher ScientificA18945Commercial human iPSC line
HepesSigma-AldrichH4034Chemicals for electrophysiological solutions
LamininSigma-Aldrich11243217001Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
NEAAThermo Fisher Scientific11140035Non-Essential Amino Acids. Used as a supplement for cell culture medium, to increase cell growth and viability.
Neon 100 &mu;L KitThermo Fisher ScientificMPK10096Cell electroporation kit
Neon Transfection SystemThermo Fisher ScientificMPK5000Cell electroporation system
Neurobasal MediumThermo Fisher Scientific21103049Basal medium designed for long-term maintenance and maturation of neuronal cell populations without the&nbsp; need for an astrocyte feeder layer
NutriStem-XF/FFBiological Industries05-100-1AHuman iPSC culture medium
PBS Ca<sup>2+</sup>/Mg<sup>2+</sup> freeSigma-AldrichD8537-500MLDulbecco's Phosphate Buffer Saline, w/o Calcium, w/o Magnesium
Penicillin/StreptomycinSigma-AldrichP4333-100MLPenicillin/Streptomicin solution used to prevent cell culture contamination from bacteria.
Y-27632 (ROCK inhibitor)Enzo Life SciencesALX-270-333-M005Cell-permeable selective inhibitor of Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase (ROCK). Increases iPSC survival

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PiggyBac Transposon-Mediated Gene Editing in Human iPSCs: A Procedure to Integrate Gene of Interest in Human iPSCs Using PiggyBac Transposon System

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PiggyBac Transposon-Mediated Gene Editing in Human iPSCs: A Procedure to Integrate Gene of Interest in Human iPSCs Using PiggyBac Transposon System. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20983, doi: (2025).

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