Edição de genes mediada por transposon PiggyBac em iPSCs humanas: um procedimento para integrar gene de interesse em iPSCs humanas usando o sistema de transposon PiggyBac
Este vídeo demonstra o procedimento para gerar neurônios motores por transfecção de iPSCs humanas com sistema de transposons PiggyBac pela expressão ectópica de fatores de transcrição específicos da linhagem.
Protocol
1. Geração de linhas iPSC induzíveis por NIL e NIP
Transfecção celular
Enxágue as células com PBS (livre de Ca2+/Mg2+).
Adicionar o reagente de dissociação celular (ver Tabela de Materiais) (0,35 ml para uma placa de 35 mm) e incubar a 37 °C até que as células individuais sejam
separado (5-10 min).
Complete suavemente a separação celular pipetando para cima e para baixo com um pipetador P1000 3-4 vezes.
Colete em um tubo de 15 mL e adicione PBS (Ca2+/Mg2+ livre) a 10 mL. Conte as células.
Pellet 106 células e ressuspender em 100 μl de tampão R (incluído no kit de eletroporação de células, consulte a Tabela de Materiais).
Adicionar DNA plasmidial para transfecção: 4,5 μg de vetor transponível (epB-Bsd-TT-NIL ou epB-Bsd-TT-NIP) e 0,5 μg do plasmídeo piggyBac transposase.
Transfect com o sistema de eletroporação de células (ver Tabela de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante com os seguintes parâmetros: tensão de 1.200 V, largura de 30 ms, 1 pulso. Semeie as células em meio iPSC humano suplementado com 10 μM de Y-27632 (inibidor de ROCK, consulte Tabela de Materiais) em um prato revestido com matriz de 6 mm.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
B27
Miltenyi Biotec
130-093-566
Serum free supplement for neuronal cell maintenance
Bambanker
Nippon Genetics
NGE-BB02
Cell freezing medium for motor neuron progenitors
CaCl<sub>2</sub>
Sigma-Aldrich
C3881
Chemicals for electrophysiological solutions
Corning Matrigel hESC-qualified Matrix
Corning
354277
Reconstituted basement membrane preparation from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma. Used for adhesion of iPSC to plastic and glass supports
CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIA
Biological Industries
05-710-1E
Freezing medium for human iPSCs
Dispase
Gibco
17105-041
Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
DMEM/F12
Sigma-Aldrich
D6421-500ML
Basal medium for cell culture
Doxycycline
Sigma-Aldrich
D9891-1G
Used to induce expression of transgenes from epB-Bsd-TT-NIL and epB-Bsd-TT-NIP vectors
DS2U
WiCell
UWWC1-DS2U
Commercial human iPSC line
GDNF
PreproTech
450-10
Glial-Derived Neurotrophic Factor
Gibco Episomal hiPSC Line
Thermo Fisher Scientific
A18945
Commercial human iPSC line
Hepes
Sigma-Aldrich
H4034
Chemicals for electrophysiological solutions
Laminin
Sigma-Aldrich
11243217001
Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
NEAA
Thermo Fisher Scientific
11140035
Non-Essential Amino Acids. Used as a supplement for cell culture medium, to increase cell growth and viability.
Neon 100 μL Kit
Thermo Fisher Scientific
MPK10096
Cell electroporation kit
Neon Transfection System
Thermo Fisher Scientific
MPK5000
Cell electroporation system
Neurobasal Medium
Thermo Fisher Scientific
21103049
Basal medium designed for long-term maintenance and maturation of neuronal cell populations without the need for an astrocyte feeder layer
PiggyBac Transposon-Mediated Gene Editing in Human iPSCs: A Procedure to Integrate Gene of Interest in Human iPSCs Using PiggyBac Transposon System. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20983, doi: (2025).