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Abstract

Fonte: Garone, M. G. et al. Conversão de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs) em neurônios motores espinhais e cranianos funcionais usando vetores PiggyBac. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra o procedimento para gerar neurônios motores por transfecção de iPSCs humanas com sistema de transposons PiggyBac pela expressão ectópica de fatores de transcrição específicos da linhagem.

Protocol

1. Geração de linhas iPSC induzíveis por NIL e NIP

1. Transfecção celular
   1. Enxágue as células com PBS (livre de Ca²⁺/Mg²⁺).
   2. Adicionar o reagente de dissociação celular (ver Tabela de Materiais) (0,35 ml para uma placa de 35 mm) e incubar a 37 °C até que as células individuais sejam
   3. separado (5-10 min).
   4. Complete suavemente a separação celular pipetando para cima e para baixo com um pipetador P1000 3-4 vezes.
   5. Colete em um tubo de 15 mL e adicione PBS (Ca^2+/Mg²⁺ livre) a 10 mL. Conte as células.
   6. Pellet 10⁶ células e ressuspender em 100 μl de tampão R (incluído no kit de eletroporação de células, consulte a Tabela de Materiais).
   7. Adicionar DNA plasmidial para transfecção: 4,5 μg de vetor transponível (epB-Bsd-TT-NIL ou epB-Bsd-TT-NIP) e 0,5 μg do plasmídeo piggyBac transposase.
   8. Transfect com o sistema de eletroporação de células (ver Tabela de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante com os seguintes parâmetros: tensão de 1.200 V, largura de 30 ms, 1 pulso. Semeie as células em meio iPSC humano suplementado com 10 μM de Y-27632 (inibidor de ROCK, consulte Tabela de Materiais) em um prato revestido com matriz de 6 mm.

Materials

B27	Miltenyi Biotec	 130-093-566	Serum free supplement for neuronal cell maintenance
Bambanker	Nippon Genetics	NGE-BB02	Cell freezing medium for motor neuron progenitors
CaCl<sub>2</sub>	Sigma-Aldrich	C3881	Chemicals for electrophysiological solutions
Corning Matrigel hESC-qualified Matrix	Corning	354277	Reconstituted basement membrane preparation from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma. Used for adhesion of iPSC to plastic and glass supports
CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIA	Biological Industries	05-710-1E	Freezing medium for human iPSCs
Dispase	Gibco	17105-041	Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D6421-500ML	Basal medium for cell culture
Doxycycline	Sigma-Aldrich	D9891-1G	Used to induce expression of transgenes from epB-Bsd-TT-NIL and epB-Bsd-TT-NIP vectors
DS2U	WiCell	UWWC1-DS2U	Commercial human iPSC line
GDNF	PreproTech	450-10	Glial-Derived Neurotrophic Factor
Gibco Episomal hiPSC Line	Thermo Fisher Scientific	A18945	Commercial human iPSC line
Hepes	Sigma-Aldrich	H4034	Chemicals for electrophysiological solutions
Laminin	Sigma-Aldrich	11243217001	Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
NEAA	Thermo Fisher Scientific	11140035	Non-Essential Amino Acids. Used as a supplement for cell culture medium, to increase cell growth and viability.
Neon 100 &mu;L Kit	Thermo Fisher Scientific	MPK10096	Cell electroporation kit
Neon Transfection System	Thermo Fisher Scientific	MPK5000	Cell electroporation system
Neurobasal Medium	Thermo Fisher Scientific	21103049	Basal medium designed for long-term maintenance and maturation of neuronal cell populations without the&nbsp; need for an astrocyte feeder layer
NutriStem-XF/FF	Biological Industries	05-100-1A	Human iPSC culture medium
PBS Ca<sup>2+</sup>/Mg<sup>2+</sup> free	Sigma-Aldrich	D8537-500ML	Dulbecco's Phosphate Buffer Saline, w/o Calcium, w/o Magnesium
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333-100ML	Penicillin/Streptomicin solution used to prevent cell culture contamination from bacteria.
Y-27632 (ROCK inhibitor)	Enzo Life Sciences	ALX-270-333-M005	Cell-permeable selective inhibitor of Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase (ROCK). Increases iPSC survival