Edição de genes mediada por transposon PiggyBac em iPSCs humanas: um procedimento para integrar gene de interesse em iPSCs humanas usando o sistema de transposon PiggyBac

Comece com uma suspensão de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos, hiPSCs, em tampão de eletroporação adequado. Adicionar uma solução constituída por plasmídeos codificadores de transposase PiggyBac e plasmídeos doadores. Eletroporar a mistura.

Os pulsos elétricos permeabilizam transitoriamente as membranas celulares, facilitando a captação celular de plasmídeos. Os plasmídeos doadores compreendem repetições terminais invertidas específicas do transposon, ITRs, que são complementos invertidos uns dos outros, flanqueados por repetições TTAA que colocam entre parênteses a proteína alvo e genes de resistência a antibióticos.

As proteínas de transposase PiggyBac expressas criam cortes nas extremidades 3 'dos ITRs, internos às repetições TTAA. Os grupos 3'-hidroxila expostos atacam o nucleotídeo da fita complementar dentro do DNA flanqueador, formando grampos de cabelo TTAA nas extremidades do transposon, liberando assim a construção do transposon do plasmídeo.

As transposases resolvem os grampos de cabelo para formar saliências de TTAA nas extremidades 5 'da construção do transposon. As transposases criam ainda quebras de fita dupla na sequência TTAA no genoma do hospedeiro. As extremidades do transposon 3'-hidroxila liberadas atacam a sequência TTAA nas extremidades escalonadas, resultando na união covalente da construção do transposon ao genoma do hospedeiro, deixando lacunas de fita simples flanqueando a construção do transposon. Essas lacunas no DNA do hospedeiro são ligadas, levando à integração estável da construção do transposon.

Trate os hiPSCs semeados em uma placa revestida de proteína de matriz extracelular com meio contendo antibióticos. O gene de resistência a antibióticos, impulsionado pelo promotor a montante, permite a seleção de células editadas por genes.