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Abstract

Fonte: Merenda, A. et al., Um protocolo para nocaute de múltiplos genes em organoides do intestino delgado de camundongos usando um concatemer CRISPR. (2017).

Este vídeo descreve uma técnica de nocaute genético usando um concatemer CRISPR para nocautear simultaneamente vários genes em células organoides intestinais de camundongos cultivadas. Este método é usado para nocautear um gene doente e elucidar a função de um gene e seus parálogos.

Protocol

1. Projeto de gRNA para o vetor concatemer CRISPR

NOTA: O objetivo desta seção é explicar como optar pela melhor estratégia de direcionamento e como projetar gRNAs contendo saliências específicas para o vetor concatemer CRISPR.

1. Projete gRNAs contra os genes de interesse usando uma ferramenta de design de gRNA CRISPR de sua escolha. Consulte a Tabela de Materiais para obter um exemplo.
   nota: Ao direcionar um par de genes parálogos, embora seja possível projetar um gRNA por gene, é aconselhável projetar dois gRNAs por gene para aumentar as chances de alcançar um nocaute duplo (Figura 1).
2. Certifique-se de que os gRNAs não contenham o local de reconhecimento BbsI usando uma ferramenta de mapeamento de restrição (consulte a Tabela de Materiais para obter um exemplo).
3. Adicione saliências vetoriais concatemeras CRISPR específicas a cada oligo, conforme mostrado na Tabela 1.

2. Clonagem de gRNAs no vetor concatemer CRISPR

1. Fosforilação e recozimento de oligos
   nota: Esta etapa ilustra como recozer as fitas superior e inferior para cada oligo de gRNA e como fosforilar suas extremidades em uma única reação.
   1. Prepare a mistura de reação para fosforilar oligos e recozimento de fitas superior e inferior em gelo, de acordo com as instruções abaixo.
      nota: Todos os oligos podem ser agrupados em uma reação; por exemplo, no caso de um vetor concatemer de 4 gRNA, agrupe 8 oligos.
   2. Para 3 concatemeros, use 3,0 μL de fita superior de gRNA (1,0 μL de cada gRNA; 10 μM, 1 μL / gRNA), 3,0 μL de fita inferior de gRNA (1,0 μL de cada gRNA; 10 μM, 1 μL / gRNA), 2,0 μL de tampão de DNA ligase T4 (10x), 1,0 μL T4 PNK e adicione H₂O até o volume total de 20,0 μL.
   3. Misture bem pipetando e execute-o em um termociclador usando as seguintes configurações: 37 ° C por 30 min, 95 ° C por 5 min, reduza para 25 ° C a 0.3 ° C / min, mantenha a 4 ° C.
2. BbsI embaralhando a reação
   nota: Nesta seção, os oligos de gRNA pré-recozidos são incorporados na posição apropriada do vetor concatemer em uma única etapa, alternando ciclos de digestão e ligação.
   1. Diluir a mistura de reação 1:100 em água livre de DNase/RNase para gerar 3 e 4 vetores concatemeros de gRNA.
      nota: Ao clonar 2 concatemers de gRNA, esta etapa não é necessária.
   2. Monte a reação de embaralhamento BbsI no gelo, de acordo com as instruções abaixo. Inclua um controle negativo que contenha apenas o vetor.
   3. Use 100 ng de vetor concatemer CRISPR, 10,0 μL de mistura de oligo, 1,0 μL de tampão enzimático de restrição contendo BSA (10x), 1,0 μL de DTT (10 mM), 1,0 μL de ATP (10 mM), 1,0 μL de BbsI, 1,0 μL de T7 ligase e H₂O até o volume total de 20,0 μL.
   4. Misture bem pipetando e execute-o em um termociclador usando as seguintes configurações: Execute 50 ciclos para clonar 3 e 4 concatemers de gRNA e 25 ciclos para 2 concatemers de gRNA, ambos a 37 ° C por 5 min, 21 ° C por 5 min, mantenha a 37 ° C por 15 min e depois 4 ° C para sempre.
3. Tratamento com exonuclease
   nota: Esta etapa é altamente recomendada, pois aumenta a eficiência da clonagem, removendo quaisquer vestígios de DNA linearizado.
   1. Trate a reação de embaralhamento BbsI com uma exonuclease de DNA (ver Tabela de Materiais) da seguinte forma.
   2. Pegue 11,0 μL de mistura de ligação da etapa anterior (2.2.3), adicione 1,5 μL de tampão exonuclease (10x), 1,5 μL de ATP (10 mM), 1,0 μL de exonuclease de DNA e aumente o volume total para 15,0 μL com água. Incubar a 37 °C por 30 min seguido de 70 °C por 30 min.
      nota: Esta etapa remove qualquer DNA linearizado residual na mistura e, assim, aumenta a eficiência da clonagem.
   3. Use 2 μL da mistura de reação para transformação em bactérias E. coli quimicamente competentes por choque térmico.
      NOTA: Alternativamente, a reação pode ser armazenada por até uma semana a -20 °C.

3. Transfecção de organoides intestinais por eletroporação

NOTA: Observe que este procedimento é baseado no protocolo publicado por Fujii et al. em 2015, com adaptação para culturas de organoides do intestino delgado de camundongos.

1. Pré-eletroporação
   nota: Esta seção descreve como preparar os organoides intestinais de camundongos antes da eletroporação, removendo todos os antibióticos e meios condicionados de seu meio de cultura. Isso evitará possíveis efeitos tóxicos durante a eletroporação.
   1. No dia 0 do procedimento de transfecção, dividir os organoides na proporção de 1:2.
      NOTA: As culturas organoides intestinais podem ser obtidas realizando o isolamento da cripta de acordo com protocolos previamente estabelecidos. Consulte a Tabela 2 para todas as composições de mídia.
      1. Ao dividir organoides para eletroporação, semeie um mínimo de 6 poços de uma placa de 48 poços por transfecção.
      2. Semeie os organoides em gotas de matriz de embasamento de 20 μL e cultive-os em meio WENR + Nic (Wnt + EGF + Noggin + R-spondin + Nicotinamida) a 37 ° C, 5% de CO₂ em uma incubadora umidificada (conforme descrito anteriormente).
   2. No dia 2, troque o meio substituindo WENR+Nic por 250 μL de EN (EGF + Noggin) + CHIR99021 (inibidor da glicogênio sintase quinase-3) + Y-27632 (inibidor de ROCK), sem antibióticos (ver Tabela 2).
      NOTA: Em todas as etapas, a quantidade de meio adicionada a cada poço de uma placa de 48 poços é de 250 μL.
   3. No dia 3, troque o meio organoide para EN + CHIR99021 + Y-27632 + 1,25% v / v Dimetilsulfóxido (DMSO), sem antibióticos.
2. Preparação das células
   nota: Aqui descrevemos como fragmentar organoides em pequenos aglomerados de células por dissociação mecânica e química. Essas etapas são essenciais para o sucesso do procedimento.
   1. No dia 4, interrompa as cúpulas da matriz basal usando uma ponta de pipeta de 1 mL e transfira organoides para um tubo de 1,5 mL. Conteúdo da piscina de quatro poços de uma placa de 48 poços em um tubo.
   2. Quebre mecanicamente os organoides em pequenos fragmentos pipetando para cima e para baixo com uma pipeta P200 aproximadamente 200 vezes. Centrifugue à temperatura ambiente, 5 min a 600 x g.
   3. Remova o meio e ressuspenda o pellet em 1 mL de uma protease recombinante de grau de cultura de células (consulte a tabela de materiais). Incubar a 37 °C por no máximo 5 min e, em seguida, verificar uma gota de 50 μL de amostra sob um microscópio de luz invertida com uma objetiva de 4x.
      nota: Aglomerados de 10 a 15 células são desejáveis, pois isso aumenta a sobrevivência celular após a eletroporação.
   4. Transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mL de baixa ligação e interrompa a dissociação adicionando 9 mL de meio basal sem antibióticos (ver Tabela 2). Centrifugue à temperatura ambiente, 5 min a 600 x g, depois descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 1 mL de meio de soro reduzido (ver Tabela de Materiais).
   5. Conte o número de células com uma câmara de Bürker e use um mínimo de 1 x 10⁵ células por reação de eletroporação. Adicione 9 mL de soro reduzido ao tubo de 15 mL e centrifugue em temperatura ambiente, 3 min a 400 x g.
3. Eletroporação
   nota: As seções a seguir fornecem instruções sobre como realizar a eletroporação e fazer com que os organoides se recuperem posteriormente.
   1. Remova todo o sobrenadante e ressuspenda o pellet em uma solução de eletroporação (consulte a Tabela de Materiais). Adicionar uma quantidade total de 10 μg de ADN à suspensão celular e adicionar solução de electroporação a um volume final de 100 μL e manter a mistura célula-ADN congelada. Use vetores concatâmeros CRISPR em combinação com um plasmídeo de expressão Cas9 (por exemplo, Addgene # 41815) em uma proporção de 1:1.
      nota: O volume total do ADN adicionado deve ser inferior ou igual a 10% do volume total da reacção.
   2. Inclua uma mistura de transfecção separada contendo um plasmídeo GFP para avaliar a eficiência da transfecção (por exemplo, pCMV-GFP, Addgene # 11153 ou qualquer plasmídeo genérico que expresse GFP).
   3. Adicione a mistura célula-DNA à cubeta de eletroporação e coloque-a na câmara do eletroporador. Meça a impedância pressionando o botão apropriado no eletroporador e certifique-se de que seja 0.030-0.055 kΩ. Realize a eletroporação de acordo com as configurações mostradas na Tabela 3.
      nota: Se o valor da impedância estiver fora da faixa permitida, ajuste o volume da solução na cubeta.
   4. Adicione 400 μL de tampão de eletroporação + Y-27632 à cubeta e, em seguida, transfira tudo para um tubo de 1,5 mL. Incube em temperatura ambiente por 30 min para permitir que as células se recuperem e, posteriormente, gire-as em temperatura ambiente por 3 min a 400 x g.
   5. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 20 μL / poço de matriz de embasamento. Semeie aproximadamente 1 x 104 a 1 x 105 células por poço em uma placa de 48 poços e adicione meio EN + CHIR99021 + Y-27632 + 1,25% v / v DMSO. Incubar a 37 °C.
   6. No dia 5, mude o meio para EN + CHIR99021 + Y-27632 e verifique a eficiência da transfecção observando a expressão de GFP (Figura 2). Manter os organoides a 37 °C e atualizar o meio EN + CHIR99021 + Y-27632 após 2 dias.
   7. No dia 9, troque o meio para WENR + Nic + Y-27632 e incube a 37 °C.
      nota: O Y-27632 pode ser removido após 7 a 10 dias (nos dias 16 a 19).

	1	2	3	4
Sequência (5′-3′)	CACCGG[gRNA1]GT	ACCGG[gRNA2]G	CCGG[gRNA3]	ACACCGG[gRNA4]GTT
Sequência (5′-3′)	TAAAAC[RC-gRNA1]CC	AAAAC[RC-gRNA2]C	AAAC[RC-gRNA3]	CTAAAAC[RC-gRNA4]CCG

Tabela 1: Saliências para cada do vetor concatemer CRISPR.

Meio basal		Comentários
Conservar a 4 °C durante 4 semanas
Meio de cultura celular	500 mL	Veja a tabela de materiais
L-Glutamina	100x 5 mL
Agente tampão 1 M	5 ml	Veja a tabela de materiais
Penicilina estreptomicina	100x 5 mL
WENR + Nic (Wnt + EGF + Noggin + Rspondin + Nicotinamida)
Conservar a 4 °C durante 2 semanas
Meio basal	até 50 mL
Suplemento sem soro de células neuronais (50x)	1 mL	Veja a tabela de materiais
Suplemento sem soro de células neuronais (100x)	500 μL	Veja a tabela de materiais
n-acetilcisteína (500 mM)	125 μL
EGF de camundongo (100 μg/mL)	25 μL
Noggin de camundongo (100 μg/mL)	50 μL
Meio condicionado R-Spondin	5 ml
Wnt3a meio condicionado	25 mL
Nicotinamida (1 M)	250 μL
EN + CHIR + Y-27632 (EGF + Noggin + CHIR + Y-27632)
Conservar a 4 °C durante 2 semanas
Meio basal sem penicilina estreptomicina	até 20 mL
Suplemento sem soro de células neuronais (50x)	400 μL	Veja a tabela de materiais
Suplemento sem soro de células neuronais (100x)	200 μL	Veja a tabela de materiais
n-acetilcisteína (500 mM)	50 μL
EGF de camundongo (100 μg/mL)	10 μL
Noggin de camundongo (100 μg/mL)	20 μL
Y-27632 (10 μM)	20 μL
CHIR99021 (8 μM)	10 μL
PT (EGF + Noggin)
Conservar a 4 °C durante 4 semanas
Meio basal	até 50 mL
Suplemento sem soro de células neuronais (50x)	1 mL	Ver Tabela de materiais
Suplemento sem soro de células neuronais (100x)	500 μL	Ver Tabela de materiais
n-acetilcisteína (500 mM)	125 μL
EGF de camundongo (100 μg/mL)	25 μL
Noggin de camundongo (100 μg/mL)	50 μL

Tabela 2: Composição de Mídia Organoide.

	Pulso poroso	Pulso de transferência
voltagem	175V	20V
Comprimento do pulso	5 segundos	50 ms
Intervalo de pulso	50 ms	50 ms
Número de pulsos	algarismo	5
Taxa de decaimento	10% de sucesso	40% de sucesso
polaridade	+	+/-

Tabela 3: Configurações de eletroporação.

Representative Results

Materials

Optimized CRISPR Design Tool 	Feng Zhang group 		CRISPR gRNA design tool; http://crispr.mit.edu/
Webcutter 2.0 			restriction mapping tool; http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/
T4 PNK (Polynucleotide Kinase) 	New England Biolabs 	M0201L
T4 DNA ligase buffer 	New England Biolabs 	M0202S
T7 DNA Ligase 	New England Biolabs	 M0318L
DTT (dithiothreitol) 	Promega 	P1171
ATP (adenosine triphosphate) 	New England Biolabs 	P0756S
FastDigest BbsI (BpiI) 	Thermo Fisher 	FD1014
Tango buffer (BSA-containing restriction enzyme buffer)	Thermo Fisher 	BY5
BglII 	New England Biolabs 	R0144
EcoRI 	New England Biolabs 	R0101
Plasmid-safe exonuclease 	Cambio 	E3101K
Thermal cycler 	Applied biosystems 	4359659
10G competent E. coli bacteria 	Cambridge Bioscience 	60108-1
Advanced DMEM/F12(cell culture medium)	Invitrogen 	12634-034
Glutamax (L-Glutamine) 	100x Invitrogen 	35050-068
HEPES 1 M (buffering agent) 	Invitrogen 	15630-056
Penicillin-streptomycin 100x 	Invitrogen 	15140-122
B27 supplement (Neuronal cell serum-free supplement) 50x	Invitrogen 	17504-044
N2 supplement (Neuronal cell serum-free supplement) 100x	Invitrogen 	17502-048
n-Acetylcysteine 500 mM 	Sigma-Aldrich 	A9165-5G
Mouse EGF 500 μg/mL 	Invitrogen Biosource 	PMG8043
Mouse Noggin 100 μg/mL 	Peprotech	 250-38
Nicotinamide 1 M 	Sigma 	N0636
R-Spondin conditioned medium 	n.a. 	n.a. 	Produced in house from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013
Wnt conditioned medium	n.a. 	n.a. 	Produced in house from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2014
Y-27632 10 μM 	Sigma-Aldrich 	Y0503-1MG
Standard BD Matrigel matrix 	BD Biosciences	356231
48-well Plate 	Greiner Bio One 	677980
CHIR99021 	Sigma-Aldrich 	A3734-1MG
IWP-2 	Cell Guidance Systems 	SM39-10
TrypLE (recombinant protease)	 Invitrogen 	12605-010
Opti-MEM (reduced serum medium)	Life technologies	 51985-034
Electroporation Cuvettes 2 mm gap 	NepaGene 	EC-002S
Low binding 15 mL tubes 	Sigma-Aldrich 	CLS430791
Bürker’s chamber 	Sigma-Aldrich	 BR719520-1EA
NEPA21 Super Electroporator 	NepaGene 	contact supplier
Protein LoBind tubes low binding	Thermo Fisher 	10708704
BTXpress electroporation buffer 	Harvard Apparatus 	45-0805
DMSO (Dimethyl sulfoxide)	 AppliChem	 A3672