Fonte: Merenda, A. et al., Um protocolo para nocaute de múltiplos genes em organoides do intestino delgado de camundongos usando um concatemer CRISPR. (2017).
Este vídeo descreve uma técnica de nocaute genético usando um concatemer CRISPR para nocautear simultaneamente vários genes em células organoides intestinais de camundongos cultivadas. Este método é usado para nocautear um gene doente e elucidar a função de um gene e seus parálogos.
1. Projeto de gRNA para o vetor concatemer CRISPR
NOTA: O objetivo desta seção é explicar como optar pela melhor estratégia de direcionamento e como projetar gRNAs contendo saliências específicas para o vetor concatemer CRISPR.
2. Clonagem de gRNAs no vetor concatemer CRISPR
3. Transfecção de organoides intestinais por eletroporação
NOTA: Observe que este procedimento é baseado no protocolo publicado por Fujii et al. em 2015, com adaptação para culturas de organoides do intestino delgado de camundongos.
1 | 2 | 3 | 4 | |
Sequência (5′-3′) | CACCGG[gRNA1]GT | ACCGG[gRNA2]G | CCGG[gRNA3] | ACACCGG[gRNA4]GTT |
Sequência (5′-3′) | TAAAAC[RC-gRNA1]CC | AAAAC[RC-gRNA2]C | AAAC[RC-gRNA3] | CTAAAAC[RC-gRNA4]CCG |
Tabela 1: Saliências para cada do vetor concatemer CRISPR.
Meio basal | Comentários | |
Conservar a 4 °C durante 4 semanas | ||
Meio de cultura celular | 500 mL | Veja a tabela de materiais |
L-Glutamina | 100x 5 mL | |
Agente tampão 1 M | 5 ml | Veja a tabela de materiais |
Penicilina estreptomicina | 100x 5 mL | |
WENR + Nic (Wnt + EGF + Noggin + Rspondin + Nicotinamida) | ||
Conservar a 4 °C durante 2 semanas | ||
Meio basal | até 50 mL | |
Suplemento sem soro de células neuronais (50x) | 1 mL | Veja a tabela de materiais |
Suplemento sem soro de células neuronais (100x) | 500 μL | Veja a tabela de materiais |
n-acetilcisteína (500 mM) | 125 μL | |
EGF de camundongo (100 μg/mL) | 25 μL | |
Noggin de camundongo (100 μg/mL) | 50 μL | |
Meio condicionado R-Spondin | 5 ml | |
Wnt3a meio condicionado | 25 mL | |
Nicotinamida (1 M) | 250 μL | |
EN + CHIR + Y-27632 (EGF + Noggin + CHIR + Y-27632) | ||
Conservar a 4 °C durante 2 semanas | ||
Meio basal sem penicilina estreptomicina | até 20 mL | |
Suplemento sem soro de células neuronais (50x) | 400 μL | Veja a tabela de materiais |
Suplemento sem soro de células neuronais (100x) | 200 μL | Veja a tabela de materiais |
n-acetilcisteína (500 mM) | 50 μL | |
EGF de camundongo (100 μg/mL) | 10 μL | |
Noggin de camundongo (100 μg/mL) | 20 μL | |
Y-27632 (10 μM) | 20 μL | |
CHIR99021 (8 μM) | 10 μL | |
PT (EGF + Noggin) | ||
Conservar a 4 °C durante 4 semanas | ||
Meio basal | até 50 mL | |
Suplemento sem soro de células neuronais (50x) | 1 mL | Ver Tabela de materiais |
Suplemento sem soro de células neuronais (100x) | 500 μL | Ver Tabela de materiais |
n-acetilcisteína (500 mM) | 125 μL | |
EGF de camundongo (100 μg/mL) | 25 μL | |
Noggin de camundongo (100 μg/mL) | 50 μL |
Tabela 2: Composição de Mídia Organoide.
Pulso poroso | Pulso de transferência | |
voltagem | 175V | 20V |
Comprimento do pulso | 5 segundos | 50 ms |
Intervalo de pulso | 50 ms | 50 ms |
Número de pulsos | algarismo | 5 |
Taxa de decaimento | 10% de sucesso | 40% de sucesso |
polaridade | + | +/- |
Tabela 3: Configurações de eletroporação.
The authors have nothing to disclose.
Optimized CRISPR Design Tool | Feng Zhang group | CRISPR gRNA design tool; http://crispr.mit.edu/ | |
Webcutter 2.0 | restriction mapping tool; http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/ | ||
T4 PNK (Polynucleotide Kinase) | New England Biolabs | M0201L | |
T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | M0202S | |
T7 DNA Ligase | New England Biolabs | M0318L | |
DTT (dithiothreitol) | Promega | P1171 | |
ATP (adenosine triphosphate) | New England Biolabs | P0756S | |
FastDigest BbsI (BpiI) | Thermo Fisher | FD1014 | |
Tango buffer (BSA-containing restriction enzyme buffer) | Thermo Fisher | BY5 | |
BglII | New England Biolabs | R0144 | |
EcoRI | New England Biolabs | R0101 | |
Plasmid-safe exonuclease | Cambio | E3101K | |
Thermal cycler | Applied biosystems | 4359659 | |
10G competent E. coli bacteria | Cambridge Bioscience | 60108-1 | |
Advanced DMEM/F12(cell culture medium) | Invitrogen | 12634-034 | |
Glutamax (L-Glutamine) | 100x Invitrogen | 35050-068 | |
HEPES 1 M (buffering agent) | Invitrogen | 15630-056 | |
Penicillin-streptomycin 100x | Invitrogen | 15140-122 | |
B27 supplement (Neuronal cell serum-free supplement) 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
N2 supplement (Neuronal cell serum-free supplement) 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
n-Acetylcysteine 500 mM | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
Mouse EGF 500 μg/mL | Invitrogen Biosource | PMG8043 | |
Mouse Noggin 100 μg/mL | Peprotech | 250-38 | |
Nicotinamide 1 M | Sigma | N0636 | |
R-Spondin conditioned medium | n.a. | n.a. | Produced in house from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013 |
Wnt conditioned medium | n.a. | n.a. | Produced in house from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2014 |
Y-27632 10 μM | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | |
Standard BD Matrigel matrix | BD Biosciences | 356231 | |
48-well Plate | Greiner Bio One | 677980 | |
CHIR99021 | Sigma-Aldrich | A3734-1MG | |
IWP-2 | Cell Guidance Systems | SM39-10 | |
TrypLE (recombinant protease) | Invitrogen | 12605-010 | |
Opti-MEM (reduced serum medium) | Life technologies | 51985-034 | |
Electroporation Cuvettes 2 mm gap | NepaGene | EC-002S | |
Low binding 15 mL tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
Bürker’s chamber | Sigma-Aldrich | BR719520-1EA | |
NEPA21 Super Electroporator | NepaGene | contact supplier | |
Protein LoBind tubes low binding | Thermo Fisher | 10708704 | |
BTXpress electroporation buffer | Harvard Apparatus | 45-0805 | |
DMSO (Dimethyl sulfoxide) | AppliChem | A3672 |