Nocaute de múltiplos genes mediado por concatemer CRISPR: uma técnica para nocautear simultaneamente vários genes por via de junção final não homóloga em células intestinais de camundongos

Para eliminar simultaneamente vários genes usando o sistema CRISPR-concatemer-Cas9, comece com um tubo contendo a suspensão de células intestinais de camundongo. Complemente o tubo com vetores concatemeros CRISPR contendo o de expressão para vários RNAs guia, ou gRNAs, integrados adjacentes uns aos outros.

Cada de gRNA é projetado sob medida para eliminar individualmente o gene pretendido. Adicione vetores de expressão que codificam a endonuclease Cas9 ao mesmo tubo. Eletroporar a mistura célula-plasmídeo - uma técnica que usa corrente elétrica para facilitar a entrada de plasmídeos na célula. Dentro da célula, a co-expressão do concatemer CRISPR e do vetor Cas9 forma sequências de gRNA e nucleases Cas9, respectivamente.

Cada sequência de gRNA se liga à enzima Cas9 correspondente, formando vários complexos Cas9-gRNA que se ligam aos locais-alvo no genoma do hospedeiro. Essa ligação ativa a enzima Cas9, que produz um corte em ambas as fitas de DNA a montante do motivo adjacente ao protoespaçador, ou local PAM. Isso resulta em uma quebra de fita dupla, ou DSB, no DNA alvo.

Na ausência de qualquer sequência homóloga ao gene alvo, o mecanismo de reparo endógeno da célula, chamado de junção final não homóloga, é acionado, permitindo que as proteínas de reparo e as moléculas de quinase se liguem no local da quebra. Mais tarde, a enzima ligase repara o DSB, resultando em modificações da sequência do gene alvo. Essas modificações interrompem a função dos genes, resultando em nocaute de vários genes.