O modelo de Cultura organotípicas Hippocampal Slice para o exame das lesões neuronais

Resumo

O modelo de cultura organoptypic hipocampo é uma fatia In vitro Modelo usado para examinar lesão neuronal em uma variedade de paradigmas. Neste artigo, vamos descrever os métodos de geração de culturas fatia e quantificar lesão neuronal.

Resumo

Cultura fatia organotípicas hipocampo é um método in vitro para analisar os mecanismos de lesão neuronal em que a arquitetura básica e composição do hipocampo é relativamente preservado ^1. O sistema de cultura organotípicas permite o exame dos efeitos neuronal, astrocíticos e microglia, mas como uma preparação ex vivo, não aborda os efeitos do fluxo de sangue, ou recrutamento de células inflamatórias periféricas. Para o efeito, este método de cultura é freqüentemente utilizado para examinar lesão hipóxico excitotoxic e aos neurônios piramidais do hipocampo, mas também tem sido usado para examinar a resposta inflamatória. Aqui nós descrevemos os métodos para a geração de culturas fatia do hipocampo do cérebro do roedor pós-parto, administrar estímulos tóxicos para induzir a lesão neuronal, e assaying e quantificar a morte neuronal no hipocampo.

Protocolo

1. Preparação

Antes de começar, montar os instrumentos necessários cirúrgica, dissecção e meios de cultura, e sete dias de ratos velhos ou filhotes de rato. O protocolo é o mesmo para mouse e preparações de ratos.

(I) Os materiais e equipamentos

• Tesoura operacional (comprimento em linha reta 6 ", cat # RS6818, Roboz, Gaithersburg, MD)
• Micro dissecando tesoura, (comprimento 4 '", cat # RS5910. Roboz, Gaithersburg, MD)
• Aço Carbono Dumont Pinças (cat # RS-5045.Roboz, Gaithersburg, MD)
• Vidro modificado "transferência" pipetas (parte inferior da pipeta Pasteur removido e suavizada pela borda)
• Aclar filme plástico cortadas a 2 "em x 2" em praças (Honeywell, # 812071, Pottsville, PA)
• Cobrir esponjas 4 em por 3 in (Kendall, cat # 3157, Mansfield, MA)
• 30 milímetros Millicell insere membrana (0,4 mm; Millipore, Bedford, MA)
• Mcllwain helicóptero Tecido com dois gumes lâmina de barbear (McIlwain helicóptero tecido, empresa Vibratome, St. Louis, MO)
• Microscópio invertido com CCD da câmera e software de análise de imagem

(Ii) Média Dissecação (DM; 1 litro em pH 7,3)

Salina balanceada de Hank	1 frasco (95,2 g/1L) (Sigma: H2387)
NHCO 3 (4,2 mM)	350 mg
HEPES (10 mM)	2,83 g
Glicose (33,3 mM)	6,0 g
Penicilina estreptomicina / (100x)	10 mL
BSA (0,3%)	300 mg
MgSO 4 7H 2 O	1,44 g

(Iii) meio de cultura (400 mL)

MEM (Invitrogen 11575-032)	200 mL
*** Sal Balanço de Hank (Invitrogen 24020-117)	100 mL
Soro de cavalo (Invitrogen 26050-070)	100 mL
HEPES buffer (1 M; Invitrogen 15630-080)	5 mL
Penicilina estreptomicina / (100x)	4 mL
*** Adicionar 12,8 g de glicose para Salt 500 mL de Hank Balance antes de fazer meio de cultura

(Iv) Animais

7 dias de idade ou filhotes de ratos rato pós-parto, geralmente uma ninhada por experimento.

2. No Dia da Cultura

1. Todas as ferramentas de dissecação e Aclar filme deve ser embebido em álcool etílico 70% por 30 minutos antes de começar. A superfície do capô, a dissecção da lâmina, e helicóptero tecido deve ser desinfetado com etanol.
2. Prepare vários (3-4) 6 placas de cultura de tecidos bem, adicione um meio de cultura mL por poço, e inserir uma membrana Millipore permeáveis ​​em cada poço. Coloque 6-bem placas no 37 ° incubadora até que esteja pronto para transferir fatias.
3. Prepare vários (4-6) 60 mm com placas DM e colocar no gelo.
4. Rapidamente decapitar com uma tesoura e mergulhe em 70% o álcool etílico, e rapidamente expor o cérebro com uma incisão sagital do crânio. Remova cuidadosamente o cérebro e coloque imediatamente em DM frio. Separá-lo em dois hemisférios e coloque cada lado medial do hemisfério para baixo em uma esponja de cobertura para 2-3 segundos.
5. Levantar delicadamente e coloque o hemisfério para a praça Aclar filme e coloque no helicóptero tecidos; corte coronal do cérebro em 350 seções mM. Quando terminar, retire com cuidado a praça Alcar com o hemisfério seccionados e submergir em DM frio.
6. Usando um microscópio de dissecação, separar as seções do hipocampo. Para ratos, deve haver cinco seções que abrangem rostral hipocampo caudal, e para mouse deve haver seções 3-4.
7. Tirar as placas de 6 poços com inserções de membrana do 37 ° de cultura de tecidos incubadora. Transferência de fatias do hipocampo individualmente para a membranas permeáveis ​​usando a pipeta de transferência de vidro. Se demasiado DM é liberado para a membrana, remover o excesso de DM com uma pipeta Pasteur. Coloque cinco fatias do hipocampo em cada membrana. Permitir que pelo menos três poços por condição, ou 15 fatias.
8. Incubar as placas de cultura a 37 ° em 5% CO incubadora umidificada por 12-14 dias antes do início do experimento de toxicidade. O meio de cultura podem ser mudadas duas vezes por semana.

3. Induzir e quantificação lesão neuronal do hipocampo em Cultura Slice

1. Depois de 12-14 dias em cultura, adicionar 5 mg / mL de iodeto de propídio (PI) para o meio de cultura. Esta etapa irá permitir a visualização e quantificação de morte celular basal.
2. No dia seguinte, quantificar PIfluorescência na sub-região CA1 (e / ou CA3 ou denteado se desejado) de cada fatia do hipocampo e obter média das medições de fluorescência PI representando a morte de células basais (referido como tempo = 0 horas, ou T _0). Para aquisição de imagem e quantificação, usamos OpenLab software (Improvisação, UK), mas a aquisição de imagens e outros softwares de análise podem ser usados ​​para quantificar a intensidade de fluorescência.
3. Imediatamente após a aquisição da imagem de T ₀ PI fluorescência, induzir lesão neuronal pelo seu método de escolha (temos usado 10 mM NMDA, oxigênio glucose-privação, ou LPS para uma hora como indutores de toxicidade neuronal ^2,5). Após o estímulo tóxicos, substituir média com meio fresco contendo 5 mg / mL PI e manter fatias durante a noite.
4. No dia 3, significa quantificar PI fluorescência da condição experimental em 24h, ou T _24.
5. Após esta aquisição de imagem, mudar imediatamente médio e adicionar 10 mM NMDA e 5 mg / mL PI e fatias de incubar durante a noite para atingir a morte neuronal máxima.
6. No dia 4, significa quantificar PI fluorescência da morte neuronal máxima, definida como T _max. Calcular a morte celular por cento da seguinte forma: (T ₂₄ - T ₀₎ / (T _{max-T 0).}

4. Resultados representante

Figura 1. (A) da linha de tempo para a geração de hipocampo e subsequente lesão experimental e de aquisição de imagem. (B) Imagens representativas de fatias do hipocampo basally (T _0), 24 horas após uma exposição de uma hora a 10 mM NMDA (T _24), e após mais 24 horas ou 10 mM NMDA para obter lesão neuronal máxima (T _max).

Discussão

Existem dois pontos importantes a seguir para garantir resultados reprodutíveis e consistentes ao replicar as experiências. Primeiro, é importante deixar que a idade fatias do hipocampo por 12-14 dias antes da experimentação. Com isolamento fatia, há uma resposta significativa da microglia e microglia permanecerá ativado por algum tempo, com um retorno a um estado de repouso ramificada ocorrem de dia 10 in vitro ^3,6. Em segundo lugar, com média de PI intensidade de fluorescência é proporcional ao núm...