A região da coroa de seqüências diferentes V3 loop do envelope glicoproteína de superfície (gp120) do HIV-1 pode ser caracterizada estruturalmente em muitos casos por in silico dobrar de posições 10-22 do loop usando um state-of-the-art Ab initio Algoritmo de dobradura. Aqui demonstramos a dobrar e avaliação da região da alça V3 da cepa R2 de HIV-1, uma cepa de neutralização excepcionalmente sensível com intrigantes propriedades funcionais.
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Artigo de método
Avaliação da dinâmica imunologicamente relevantes Terciário características estruturais do HIV 1-V3 loop Sequence R2 Crown por Ab initio Folding
Neste artigo
Resumo
Resumo
A diversidade antigênica do HIV-1 tem sido um obstáculo para a concepção de uma vacina, e esta variabilidade é especialmente pronunciado na alça V3 do vírus da glicoproteína do envelope superfície. Nós já propôs que a coroa da alça V3, embora variável dinâmica e seqüência, é limitada por toda a população de vírus HIV-1 a uma imunologicamente relevantes estrutura β-hairpin terciário. Importante, existem milhares de diferentes seqüências de coroa V3 loop em que circulam os vírus HIV-1, fazendo caracterização estrutural 3D de tendências através da diversidade de vírus difícil ou impossível por cristalografia ou RMN. Nossos estudos anteriores de sucesso com dobramento da coroa V3 1, 2 utilizado o algoritmo ab initio 3 acessíveis no pacote de software ICM-Pro molecular modelagem (Molsoft LLC, La Jolla, CA) e sugeriu que a coroa da alça V3, especificamente de posições 10 a 22, suficientemente benefícios da flexibilidade e comprimento de suas hastes de acompanhamento a comportar-se em grande medida, como se fosse um peptídeo unconstrained dobrar livremente em solução. Como tal dobrar initio, ab rápida de apenas parte deste do loop V3 de qualquer estirpe individuais dos 60.000 + circulantes do HIV-1 cepas podem ser informativo. Aqui, nós dobrado o loop V3 da linhagem R2 para obter insights sobre a base estrutural de suas propriedades únicas. R2 traz uma seqüência de loop rara V3 pensado para ser responsável pela extraordinária sensibilidade desta estirpe a neutralização pelo soro do paciente e anticorpos monoclonais 4, 5. A media tensão CD4-independentes infecção e aparece de obter os anticorpos neutralizantes. Demonstramos como avaliação dos resultados do dobrável pode ser informativo para associar estruturas observadas na dobradura com as atividades imunológicas observadas para R2.
Protocolo
1. Metodologia
- A primeira etapa do protocolo é para selecionar a seqüência coroa V3 você deseja passar in silico. Para a cepa R2, a seqüência para este fragmento é KSIPMGPGRAFYT.
- A estrutura 3D atômicas do peptídeo correspondente a esta seqüência deve ser construída no espaço virtual do computador. O comando ICM para isso é:
buildpep "KSIPMGPGRAFYT"
ou Arquivo: Novo: Peptide podem ser seleccionados no âmbito do menu suspenso - Vários parâmetros do procedimento são, então, definido, incluindo o número de etapas de pesquisa (duração da pesquisa), a temperatura da simulação, os parâmetros de busca estratégia, incluindo restrições ao viés de variável a busca para áreas razoáveis, termos de energia, a seleção de diferentes métodos de cálculo de energia, e parâmetros indicando como a pesquisa será registrada como se para gravar um filme e quantas conformações pontuação intermédio devem ser registados. Todos estes parâmetros foram otimizados por publicações anteriores (ver www.molsoft.com).
- O dobramento é, então, iniciado com o comando:
montecarlo
ou Arquivo: Novo: Peptide podem ser seleccionados no âmbito do pull down menu de Mecânica Molecular: Minimize: Global
No primeiro caso, os parâmetros a partir do passo 3 deve ser definido um por um na linha de comando. Neste último caso, caixas de seleção para os parâmetros mais comumente escolhidos são fornecidos em um painel antes do comando é executado. Por conveniência, o mesmo roteiro utilizado para dobrar ICM esta experiência e experimentos publicados anteriormente é mostrado aqui:
Este script pode ser salvo em um arquivo de texto e rodar na linha de comando do computador do sistema operacional (geralmente LINUX) rapidamente usando o comando:
icm _foldingscript
2. Segredos para o Sucesso
- O laço V3 é uma constante 35 aminoácidos de comprimento em quase todos os estirpe conhecida, então as posições de aminoácidos estão numerados de 1-35 a partir do dissulfeto cistina originário ligados a 1 e encerra com o dissulfeto correspondente ligados cistina a 35. Uma vez que é parte de um loop, os limites da coroa de V3 deve ser cuidadosamente escolhido. Se for demasiado grande fragmento de um for escolhido, é improvável que se comportam como um segmento flexível livremente como se fosse um peptídeo livre, assim que a simulação de dobramento não avaliar corretamente a estrutura. Se for muito pequeno fragmento de um for escolhido, a estrutura informativa terciário não podem formar-se a simulação. Nosso estudo anterior mostrou que o fragmento da posição 10 para a posição 22 correlacionado com anticorpo ligado conformações cristalográficas, de modo que este é o fragmento de qualquer loop V3, que deve ser escolhido para dobrar.
- Apesar de menus usando a interface gráfica do usuário e pull-down é user-friendly, o trabalho prévio de sucesso em dobrar peptídeo em geral usando ICM e V3 loop de coroa dobrar utilizados, em especial o script acima, simplesmente modificando a seqüência na linha buildpep e executando o script acima da linha de comando é recomendado.
3. Resultados representante
Os resultados para a dobradura R2 são representativos dos resultados para qualquer loop V3. Para avaliar os resultados, o arquivo de projeto (que será chamado "newProject1.icb" a partir do script acima) devem ser abertos e "Mecânica Molecular, Stack, View" escolhido. A mesa do conformações pilha irá aparecer. As conformações pilha pode ser visualizada graficamente, clicando no ícone Plot / Histograma. "Molecular Mecânica, Stack Play," fará um filme da pilha para apreciar o visual preferências conformacionais descobertos pela dobradura. Para a sequência R2, a conformação é beta-hairpin-like como o esperado para V3 loops 2 - especialmente no fragmento em posições 12-14 em que uma preferência vertente β-claro é visto em toda a pilha, e muito poucos alfa-helicoidal conformações são vistos. Além disso, um gap de energia de quase 3 unidades é visto entre a conformação de menor energia ea conformação de energia mais baixo segundo. Do ponto de vista energético, isso significa que a única estrutura treme fora da conformação de energia mais baixo menos de um por cento do tempo: os resultados dobrar, portanto, sugerem que o R2 V3 coroa é uma superfície rígida, e não a estrutura, flexível. Pode haver mais importantes características estruturais no conjunto de conformações, mas eles são difíceis de apreciar sistematicamente.
| JRFL | SF162_V3JRFL | SF162_V3R2 | |
| 447-52D GMT 50 | 15 | 0,00061 | 0,00078 |
Tabela 1: neutralização relativa de JRFL V3 e R2 loops em ambientes mascarados e desmascarado. Os dados foram previamente relatados em Cardozo T., et al. ARHR (2008) e Pinter, A., et. al J. Virol (2004). Resumidamente, a actividade neutralizante foi determinada com um ensaio de infectividade de ciclo único com PSVs gerado com o env-defeito-luciferase expressar pNL4-3.Luc.RE-plasmídeo pseudotyped com o Env JRFL ou o SF162 variantes V3 descrito acima: SF162_V3JRFL contém o JRFL V3 seqüência de loop no lugar da seqüência de loop SF162 V3. SF162_V3R2 contém a sequência R2 V3 loop no lugar da seqüência de loop SF162 V3. As PSVs foram incubadas com diluições de série do mAb 447-52D por 1,5 h a 37 ° C, e então adicionado ao CD4 + CCR5 + U87 células-alvo banhado em placas de 96 poços na presença de polibrene (10 mg = mL). Após 24 horas, as células foram realimentadas com meio RPMI contendo 10% FBS e 10 mg = mL polibrene, seguido de um h 24-48 adicionais de incubação. Atividade de luciferase foi determinada 48-72 postinfection h com um luminómetro placa de microtitulação (Harta, Inc.), utilizando os reagentes do ensaio da Promega, Inc. títulos médios geométricos para a neutralização de 50% (GMT50) por 447-52D foram determinados por interpolação de curvas de neutralização e são médias de pelo menos três ensaios independentes.
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Discussão
Ab initio dobrar revela terciário propriedades estruturais, cujos efeitos podem não ser evidentes de estudar aminoácidos individuais seqüencialmente. Vários anteriormente obscuro propriedades estruturais do V3 loop de coroa R2 são revelados pela simulação de dobradura. Estas preferências observadas estruturais pode se correlacionar com propriedades funcionais observado da linhagem R2, ou seja, sensibilidade à neutralização e hyperinfectivity 5.
Primeiro, uma tendência β v...
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
O trabalho foi suportado por doações da Fundação Bill e Melinda Gates Foundation (# 38631) e do NIH, incluindo OD004631 DP2 e R01 AI084119.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| ICM-Pro | Molsoft LLC |
Referências
- Almond, D., Kimura, T., Kong, X., Zolla-Pazner, S. &, Cardozo, T. Dynamic characterization of the V3 loop crown. Antiviral Therapy. 12, 13-31 (2007).
- Almond, D., Kimura, T., Kong, X., Swetnam, J., Zolla-Pazner, S., Cardozo, T. Structural conservation predominates over sequence variability in the crown of HIV type 1's V3 loop. AIDS Res Hum Retroviruses. 26, (2010).
- Abagyan, R., Totrov, M. Biased probability Monte Carlo conformational searches and electrostatic calculations for peptides and proteins. J Mol Biol. 235, 983-1002 (1994).
- Quinnan, G. V., Zhang, P. F., Fu, D. W., Dong, M., Alter, H. J. Expression and characterization of HIV type 1 envelope protein associated with a broadly reactive neutralizing antibody response. AIDS Res Hum Retroviruses. 15, 561-5670 (1999).
- Zhang, P. F., Bouma, P., Park, E. J. A variable region 3 (V3) mutation determines a global neutralization phenotype and CD4-independent infectivity of a human immunodeficiency virus type 1 envelope associated with a broadly cross-reactive, primary virus-neutralizing antibody response. J Virol. 76, 644-655 (2002).
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Reimpressões e permissões
