Visualização dos Intermediários UV-induzida replicação em E. coli Usando bidimensional Análise Agarose-gel

Resumo

Nós apresentamos um procedimento pelo qual duas dimensões de análise agarose-gel pode ser usado para identificar a estrutura de intermediários de replicação que ocorrer após a irradiação UV.

Resumo

Replicação imprecisa na presença de danos no DNA é responsável pela maioria dos rearranjos celular e mutagênese observado em todos os tipos de células e é acreditado extensamente para ser diretamente associada ao desenvolvimento de câncer em seres humanos. Danos ao DNA, como a induzidas por radiação UV, severamente prejudica a capacidade de replicação para duplicar o modelo genômico com precisão. Uma série de produtos de genes foram identificados que são necessários quando a replicação de DNA encontros lesões no modelo. No entanto, um desafio restante foi para determinar como essas lesões proteínas processo durante a replicação

Protocolo

1. Crescimento e irradiação UV.

1. 200μl de uma cultura fresca durante a noite contendo o plasmídeo pBR322 cultivadas em Davis meio ¹ suplementado com glicose 0,4%, 0,2% casamino ácidos, e 10 mcg / ml timina (médio DGCthy) e 100 mg / ml ampicilina é peletizada. O pellet celular é então ressuspenso em meio DGCthy 200μl falta ampicilina e usada para inocular 20 ml de meio de DGCthy.
2. Culturas são cultivadas sem ampicilina seleção em uma incubadora de agitação a 37 ° C para um OD ₆₀₀ de 0,5 (~ 5 x 10 ⁸ células / ml). Crescimento sem ampicilina evita seleção contra intermediários de replicação anormal ou improdutivas que ....

Discussão

Resultados típicos obtidos a partir de células de tipo selvagem, na presença e ausência de UV induzida por danos são mostrados na Figura 1. Na ausência de danos, cerca de 1% do DNA total plasmídeo pode ser encontrado no arco Y quando as células estão crescendo rapidamente em fase exponencial. Após a irradiação, um aumento transitório no Y moléculas em forma é observado como garfos de replicação bloqueados acumular em locais danificados. Os intermediários em forma de X replicação também transitoriamente acumular e persis.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Um exemplo da análise Southern do gel 2D sonda	GE Healthcare	G15T8	Iluminação amarela
Lâmpada germicida de 15 μwatt	Sylvania	F20T12/GO	Lâmpada UV
Medidor de intensidade UV Blak-Ray 254 nm	Daigger	EF28195T	Fotômetro UVC
Discos com poros de 0,025 μm	Whatman, GE Healthcare	VSWP04700	Discos de diálise flutuantes
PvuII	Fermentas	ER0632	Endonuclease de restrição
Kit de tradução com corte (nick-translation)	Roche Group	976776	Para produzir sonda marcada com 32P
Papel de transferência	Whatman, GE Healthcare	3030-704	Para transferência Southern
Membrana de náilon	GE Healthcare	RPN203S	Para transferência Southern