Artigo de método

Enzyme-linked immunospot Assay (ELISPOT): Quantificação de Th-1 respostas imunes celulares contra antígenos microbianos

DOI:

10.3791/2221

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23 de novembro de 2010

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1Department of Medicine, Vanderbilt University School of Medicine, 2Department of Microbiology and Immunology, Vanderbilt University School of Medicine

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Identificação de alvos microbiana da imunidade adaptativa em doenças idiopática pode ser realizado através da utilização do ensaio immunospot enzyme-linked.

Resumo

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Imunidade adaptativa é um componente importante para eliminação de patógenos intracelulares. A capacidade de detectar e quantificar essas respostas em seres humanos é uma importante ferramenta de diagnóstico. O ensaio de enzyme-linked immunospot (ELISPOT) está ganhando popularidade por sua capacidade de identificar respostas imunes celulares contra antígenos microbianos, incluindo populações imunossuprimidos, como aqueles com infecção pelo HIV, transplante e uso de esteróides. Este ensaio tem a capacidade de quantificar as respostas imunes contra antígenos microbianos específicos, bem como distinguir se estas respostas são Th1 ou Th2 em caráter. ELISPOT não se limita ao local da inflamação. É versátil na sua capacidade para avaliar a resposta imune no sangue periférico, bem como sites de envolvimento ativo, como lavado broncoalveolar, líquor cerebral, e ascite. Detecção de resposta imunológica contra um antígeno único ou múltiplo é possível, bem como epitopos específicos dentro de proteínas microbianas. Este ensaio facilita a detecção das respostas imunes ao longo do tempo, assim como distinções na antígenos reconhecidos pelas células T host. Ensaios de ELISPOT dupla de cores estão disponíveis para a detecção de expressão simultânea de duas citocinas. Aplicações recentes para esta técnica incluem o diagnóstico de tuberculose extrapulmonar, bem como a investigação da contribuição de antígenos infecciosos de doenças auto-imunes.

Protocolo

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Para o protocolo a seguir, usamos células mononucleares do sangue periférico (PBMC) como as células de interesse. No entanto, este protocolo pode ser usado com outros tipos celulares. Realizar o ensaio em uma capa de cultura de tecido usando a técnica estéril.

Dia 1: Elaboração de Placa e Células

  1. Tirar uma placa de ELISPOT e abri-lo no bairro.
  2. Lavar a placa 3 vezes com 150 mL de PBS 1X usando um pipetador multicanal, se disponível, caso contrário, pipetagem único bem é aceitável.
  3. Retire um pacote de reservatórios e abri-lo no capô.
  4. Adicione 2 mg / mL do anticorpo de captura, anti-h....

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Discussão

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O ensaio de ELISPOT tem emergido como um dos ensaios mais importantes e amplamente utilizados para monitorar as respostas imunes em humanos e uma variedade de outras espécies. Com o ensaio ELISPOT, as freqüências de células imunes podem ser medidos no nível da célula única, sem expansão ou a manipulação de populações de células. ELISPOT tem sido amplamente aplicado para investigar antígeno específico respostas imunes em várias doenças, incluindo infecções, câncer, alergias e doenças auto-imunes. A aplicação deste ensaio.......

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Divulgações

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Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

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Apoiado em parte pela Vanderbilt CTSA conceder um UL1 RR024975 do Centro Nacional de Pesquisa de Recursos, National Institutes of Health. Este trabalho foi financiado pelo NIH R01 HL 83839; R01 AI 65744.

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Materiais

A. Preparação de Mídia

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B. Elaboração de Tris tampão

  1. Adicione 800 ml de DDH 2 O a 1 copo L.
  2. Medida 12 gramas de Tris e adicione ao copo.
  3. Adicionar 0,12 gramas de cloreto de magnésio hexa-hidratado (MgCl 2: 6H 2 O) no copo.
  4. Mexa com vara de agitação magnética na placa de agitação automática.
  5. Uma vez dissolvido, pH da solução para 9,5.
  6. Adicionar 200 mL de DDH 2 O para o copo, levando-o até 1000ml.
  7. Filtrar a solução com um filtro de 0,22 mM.

C. Materiais necessários para as análises ELISPOT:

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Referências

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  1. Dosanjh, D. P., Hinks, T. S., Innes, J. A., Deeks, J. J., Pasvol, G., Hackforth, S., Varia, H., Millington, K. A., Gunatheesan, R., Guyot-Revol, V., Lalvani, A. Improved diagnostic evaluation of suspected tuberculosis. Ann Intern Med. 148, 325-336 (2008).
  2. Sung, H. K. E.

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