Identificação de alvos microbiana da imunidade adaptativa em doenças idiopática pode ser realizado através da utilização do ensaio immunospot enzyme-linked.
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Artigo de método
Enzyme-linked immunospot Assay (ELISPOT): Quantificação de Th-1 respostas imunes celulares contra antígenos microbianos
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Imunidade adaptativa é um componente importante para eliminação de patógenos intracelulares. A capacidade de detectar e quantificar essas respostas em seres humanos é uma importante ferramenta de diagnóstico. O ensaio de enzyme-linked immunospot (ELISPOT) está ganhando popularidade por sua capacidade de identificar respostas imunes celulares contra antígenos microbianos, incluindo populações imunossuprimidos, como aqueles com infecção pelo HIV, transplante e uso de esteróides. Este ensaio tem a capacidade de quantificar as respostas imunes contra antígenos microbianos específicos, bem como distinguir se estas respostas são Th1 ou Th2 em caráter. ELISPOT não se limita ao local da inflamação. É versátil na sua capacidade para avaliar a resposta imune no sangue periférico, bem como sites de envolvimento ativo, como lavado broncoalveolar, líquor cerebral, e ascite. Detecção de resposta imunológica contra um antígeno único ou múltiplo é possível, bem como epitopos específicos dentro de proteínas microbianas. Este ensaio facilita a detecção das respostas imunes ao longo do tempo, assim como distinções na antígenos reconhecidos pelas células T host. Ensaios de ELISPOT dupla de cores estão disponíveis para a detecção de expressão simultânea de duas citocinas. Aplicações recentes para esta técnica incluem o diagnóstico de tuberculose extrapulmonar, bem como a investigação da contribuição de antígenos infecciosos de doenças auto-imunes.
Protocolo
Para o protocolo a seguir, usamos células mononucleares do sangue periférico (PBMC) como as células de interesse. No entanto, este protocolo pode ser usado com outros tipos celulares. Realizar o ensaio em uma capa de cultura de tecido usando a técnica estéril.
Dia 1: Elaboração de Placa e Células
- Tirar uma placa de ELISPOT e abri-lo no bairro.
- Lavar a placa 3 vezes com 150 mL de PBS 1X usando um pipetador multicanal, se disponível, caso contrário, pipetagem único bem é aceitável.
- Retire um pacote de reservatórios e abri-lo no capô.
- Adicione 2 mg / mL do anticorpo de captura, anti-h....
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Discussão
O ensaio de ELISPOT tem emergido como um dos ensaios mais importantes e amplamente utilizados para monitorar as respostas imunes em humanos e uma variedade de outras espécies. Com o ensaio ELISPOT, as freqüências de células imunes podem ser medidos no nível da célula única, sem expansão ou a manipulação de populações de células. ELISPOT tem sido amplamente aplicado para investigar antígeno específico respostas imunes em várias doenças, incluindo infecções, câncer, alergias e doenças auto-imunes. A aplicação deste ensaio.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Apoiado em parte pela Vanderbilt CTSA conceder um UL1 RR024975 do Centro Nacional de Pesquisa de Recursos, National Institutes of Health. Este trabalho foi financiado pelo NIH R01 HL 83839; R01 AI 65744.
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Materiais
A. Preparação de Mídia
B. Elaboração de Tris tampão
- Adicione 800 ml de DDH 2 O a 1 copo L.
- Medida 12 gramas de Tris e adicione ao copo.
- Adicionar 0,12 gramas de cloreto de magnésio hexa-hidratado (MgCl 2: 6H 2 O) no copo.
- Mexa com vara de agitação magnética na placa de agitação automática.
- Uma vez dissolvido, pH da solução para 9,5.
- Adicionar 200 mL de DDH 2 O para o copo, levando-o até 1000ml.
- Filtrar a solução com um filtro de 0,22 mM.
C. Materiais necessários para as análises ELISPOT:
Referências
- Dosanjh, D. P., Hinks, T. S., Innes, J. A., Deeks, J. J., Pasvol, G., Hackforth, S., Varia, H., Millington, K. A., Gunatheesan, R., Guyot-Revol, V., Lalvani, A. Improved diagnostic evaluation of suspected tuberculosis. Ann Intern Med. 148, 325-336 (2008).
- Sung, H. K. E.
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Reimpressões e permissões
