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Indução e monitorização de EAE crónica recidivante
A emulsão é uma mistura 1:1 do antígeno em solução aquosa adicionado ao complementada adjuvante de Freund completo. É muito importante adicionar o antígeno ao adjuvante e não o contrário!
Há uma grande quantidade de resíduos ao fazer e injetando uma emulsão. Sempre preparar 1,5 ou 2 vezes mais do que o que você precisa.
Use argamassa autoclavado, pilão, seringas de vidro, e pontes. Todos os plásticos devem ser estéreis. A preparação pode ser feito em uma bancada de laboratório regular.
1. Preparação do adjuvante complementado
Pesar 30 mg de Mycobacterium tuberculosis (Difco catalogo 231.141) e coloque em um pilão. Transformar em pó fino sem pressionar demasiado duro para evitar quebrar as bactérias. Adicionar 10 ml de adjuvante completo de Freund H37Ra (Difco catalogo 231.131) e misturar. Este adjuvante complementada agora contém 4 mg / ml Mycobacterium tuberculosis. Transferir para um tubo.
2. Preparação do homogenato medula espinhal
Coletar medula espinhal de ratos DA (idade / sexo indiferente) e armazenar congelado a -80 ° C. Pesar os cabos congelados espinhal para ter o suficiente para mistura 1:1 (peso: volume) com o adjuvante suplementado. Picar a medula espinhal mais fino possível com uma lâmina de barbear, a transferência para a argamassa usada na seção 1, e fazer um colar com o pilão.
3. Preparação da emulsão
- Lugar complementada completa adjuvante de Freund em um tubo. Vortex em alta velocidade. Adicionar a queda da medula espinhal homogeneizado a gota enquanto vórtex. Quando todos os homogeneizado medula espinhal é adicionada vórtice, por mais 5 minutos. A mistura deve virar rosa claro.
- Coloque a emulsão em uma seringa de vidro de 5 ml e vinculá-lo para outra seringa de vidro 5 ml usando uma ponte de 18G (Fisher catálogo # 14-825-17L). Enviar a emulsão de uma seringa para o outro até que se torne rígido (5-10 min). Se mais de 5 ml de emulsão é preparada, use várias seringas 5 ml NÃO use seringas maiores.
- A emulsão pode ser armazenada nas seringas a 4 ° C por 3 semanas. Eu recomendo prepará-la pelo menos 12 horas de antecedência para verificar se ele não quebrar. Ele deve permanecer espessa e não separados em duas fases. A cor irá mudar durante a noite para uma luz amarela ou bege.
4. Imunização dos ratos
- Misture a emulsão nas seringas por alguns minutos e transfira para a seringa utilizada para a injeção. Injetar 200 mL por via subcutânea na própria base da cauda usando agulhas 23G e 3 ml seringas Luer-Lock em curto prazo anestesia.
- Os destinatários são 7-9 semanas de idade ratas DA. Ficamos com nossos ratos de Harlan Sprague Dawley-.
- Ratos devem ser observadas duas vezes por dia e pesados diariamente. Os sinais clínicos são esperados 7-15 dias após a injeção da emulsão.
Pontuação clínica:
0: sem doença
0.5: cauda limp distal
Um: tail limp
2: paraparesia leve, ataxia
3: paraparesia moderada, as viagens ratos de vez em quando
3.5: um dos membros posteriores é paralisado, os outros movimentos
4: paralisia de membros posteriores completo
5: paralisia de membros posteriores e completa incontinência
6: dificuldade em respirar moribunda, não comer ou beber. Euthanize imediatamente.