Grande Escala Zebrafish-Based In vivo Tela pequena molécula

Resumo

Peixe-zebra tem emergido como uma poderosa In vivo Plataforma para telas baseadas em fenótipo de drogas e análise química genética. Aqui, nós demonstramos um método simples e prática em larga escala de triagem de pequenas moléculas usando embriões zebrafish.

Resumo

Dado o seu tamanho pequeno embrião, o rápido desenvolvimento, a transparência, a fecundidade, e numerosas semelhanças moleculares, morfológicas e fisiológicas para os mamíferos, peixe-zebra tem emergido como uma poderosa

Protocolo

1) Coleta Egg Zebrafish

1. Na tarde anterior ao dia da tela químicos, criado 10-20 tanques de criação de peixe-zebra. Encher cada tanque com água do sistema de aquicultura. Usando uma rede de pesca, a transferência de um adulto do sexo masculino e 1-2 fêmeas adultas para recipiente interno em cada tanque de criação. Separar os peixes machos e fêmeas do outro com uma divisória. Rótulo as gaiolas e colocar uma tampa em cima deles.
2. Na manhã da tela, remover os divisores de tanques de criação e permitir zebrafish para acasalar. Ao longo de 1 hora seguinte, permitem ovos fertilizados para cair através de grade no fundo de cada recipiente interior.
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Discussão

Ao planejar uma tela químicos baseados em zebrafish, atenção especial deve ser dada a robustez do fenótipo em questão e da taxa de fundo de fenótipo tal. Isto é particularmente importante para as telas de supressores químicos de um fenótipo induzido. Por exemplo, para um fenótipo causado por choque térmico a indução de um transgene, a condição que induz o fenótipo reproducibly deve ser precisamente traçada antes de iniciar a tela para evitar inaceitavelmente elevado as taxas de falsos positivos. Com um planejamento cuid.......

Materiais

1. Mínimo de 20 pares de peixe-zebra adulto do genótipo desejado.
2. Redes de peixes, tanques de criação, com recipiente interno removível e divisores (Habitats Aquáticos).
3. Placas de Petri (10 cm).
4. Coador de chá de plástico.
5. Lavar garrafa de água embrião containg.
6. Pipetas de transferência descartável de polietileno.
7. Poliestireno de 96 poços de fundo redondo de placas de ensaio (Corning COSTAR; Lowell, MA).
8. Pasteur de vidro pipeta (Fisher Scientific).
9. Manual da bomba de pipeta, 10 mL (Bel-Art Products, Pequannock, NJ).
10. Médio embrião E3: 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl _2, 0,33 mM MgSO _4, contendo 0,003% PTU (feniltio-carbamida, Sigma, St. Louis, MO). PTU pode ser preparado como uma solução 10x dissolvendo 0,3 g-PTU em 1 L de mídia embrião E3. Soluções contendo PTU deve ser protegido da luz, cobrindo com papel alumínio.
11. 12 canais pipetas, 20-20 mL (Eppendorf).
12. 12 canais pipetas, 300-300 mL (Eppendorf).
13. Descartáveis ​​de poliestireno pipeta bacia, 50 mL (Fisher Scientific).
14. Biblioteca pequena molécula de compostos estruturalmente diversos, dispostos em um formato de 96 wll menos 10 ações mM em DMSO. Cada prato principal é aliquotado em placas de 96 poços de armazenamento de polipropileno (Corning), e armazenadas a -80 ° C até o uso.
15. Vedação de alumínio fita para placas de 96 poços (Nunc, Rochester, NY).
16. DMSO (Sigma, St. Louis, MO).
17. Básicos incubadora, 28,5 ° C (Fisher Scientific).
18. Estereomicroscópio com base de luz transmitida (Leica Microsystems, Bannockburn, IL).