Grampo patch e Técnicas de Perfusão para estudar canais iônicos Expresso em Xenopus Oócitos

Resumo

Corrente iônica de canais BK é gravado usando técnicas de patch clamp. Canais BK são expressos em Oócitos Xenopus Através da injeção de RNA mensageiro. A solução intracelular durante gravações de patch clamp é controlado por um sistema de perfusão.

Resumo

O protocolo aqui apresentado foi concebido para estudar a ativação da condutância grande tensão e Ca ^{2 +-K +} ativados (BK) canais. O protocolo também pode ser usado para estudar a relação estrutura-função de canais iônicos e outros receptores de neurotransmissores ^1. Canais BK são amplamente expressos em diferentes tecidos e têm sido implicados em muitas funções fisiológicas, incluindo a regulação da contração do músculo liso, Afinação da frequência de células ciliadas internas e regulação da liberação de neurotransmissores ^2-6. BK canais são ativados por despolarização da membrana e por Ca ^{2 +} intracelular e Mg ^{2 + 6-9.} Portanto, o protocolo é projetado para controlar a tensão de membrana ea solução intracelular. Neste protocolo, o RNA mensageiro dos canais BK é injetado dentro de oócitos Xenopus laevis (estágio V-VI), seguido de 2-5 dias de incubação a 18 ° C ^10-13. Remendos da membrana que contêm um ou vários canais BK são excisadas com a configuração de dentro para fora usando técnicas de patch-clamp ^10-13. O lado intracelular do patch é perfundido com soluções desejadas durante a gravação de modo que a ativação de canais em diferentes condições podem ser examinados. Para resumir, o mRNA de canais BK é injetado dentro de oócitos Xenopus laevis para expressar proteínas canal na membrana do oócito; técnicas de patch clamp são usados ​​para gravar correntes que fluem através dos canais sob tensão controlada e soluções intracelular.

Protocolo

1. Injeção de mRNA em oócitos

1. Injetar 0,05-50 ng de RNA mensageiro que foi transcrita in vitro em oócitos Xenopus laevis (estágio V-VI), utilizando Nanoject II Auto-nanolitros Injector (Drummond empresa Scientific, modelo 3-000-204). Repetir a injecção em uma dúzia de ovócitos para cada mRNA.
2. Enxágüe os oócitos injetados duas vezes com solução ND-96 (96 mM de cloreto de sódio (NaCl, deputado 58,44 g / mol), 2 mM de cloreto de potássio (KCl, deputado 74,56 g / mol), 1,8 mM de cloreto de cálcio (CaCl ₂ • 2H ₂ O , o Sr. 147,02), 1 mM de cloreto de magnésio (MgCl ₂ • 6H ₂ O, o Sr. 203,31 g / mol), 5 mM 4 - (2-hidroxietil)-1-piperazineethanesulfonic ácido (HEPES, deputado 238,31 g / mol), 2,5 mM piruvato de sódio (Mr 110,04 g / mol), pH e 1x penicilina-estreptomicina. 7.6), em seguida, colocá-los em uma placa de cultura e incubar a 18 ° C por 2 dias +.

2. Preparando o sistema de perfusão

Ilustração do sistema de perfusão Automatize ValveLink 16. O sistema de perfusão usa nitrogênio pressurizado para empurrar soluções para perfusão fora dos reservatórios de solução, através da perfusão tubulações, e para o lápis de perfusão e gorjeta. O fluxo de cada fluxo de solução de perfusão é controlada por uma válvula do reservatório e uma válvula eletrônica. Neste protocolo, um dos reservatórios não é pressurizado e funciona como um coletor de resíduos, bem como um mecanismo de liberação de pressão. (Imagem adaptada de http://www.autom8.com fornecedor website)

1. Conectar as tubulações para o lápis de perfusão. Ligue o controlador de válvula eletrônica e abrir as válvulas eletrônicas.
2. Para assegurar que as tubulações e os lápis de perfusão são livres de bolhas de entupir e ar, empurrar a água (DI) deionizada através de cada tubo usando uma seringa com água deionizada.
3. Conecte o tubulações aos reservatórios solução e abrir a válvula do cilindro de gás nitrogênio pressurizado para aplicar.
4. Abrir a válvula do reservatório para encher o tubo com a solução do reservatório. Flick da válvula do reservatório para remover as bolhas na solução, se necessário. Feche a válvula após o tubo é preenchido com a solução.
5. Preencha a ponta de perfusão com água e aperte-o para o lápis de perfusão. Tenha cuidado para não prender as bolhas ao se conectar a ponta.
6. Fixar o lápis de perfusão para o palco banho usando massa de modelar. Certifique-se que a ponta de perfusão é no espaço do banho. O sistema de perfusão está agora configurado.
7. Adicione a água DI no banho. Certifique-se que a ponta de perfusão está submerso na água.
8. Teste que cada solução de perfusão sai da ponta de perfusão corretamente. Fechar a válvula eletrônico conectado à tubulação do coletor de resíduos e abrir a válvula para uma solução de perfusão de cada vez (140 mM de hidróxido de potássio (KOH, M _r 56,1 g / mol), 20 mM 4 - (2-hidroxietil) -1 - piperazineethanesulfonic ácido (HEPES, M _r 238,31 g / mol), 2 mM de cloreto de potássio (KCl, M _r 74,56 g / mol), 1 mM de etileno glicol bis (2-aminoethylether)-N, N, N ', N'- tetraacetic ácido (EGTA, M _r 380,35 g / mol), pH é ajustado para 7,1-7,2 por metanosulfonico ácido (meso _3, M _r 96,1 g / mol), Ca ^{2 +} ou Mg2 + é adicionado à concentração desejada quando necessário). Sob o microscópio, observe o jato de líquido de perfusão que sai da ponta de perfusão. Fechar a válvula para solução de perfusão e abrir a válvula para o coletor de resíduos. O jato de perfusão deve quase desaparecer. Repita o mesmo teste para todas as soluções para perfusão.
9. Quando você tiver verificado que todas as soluções de fluxo de perfusão corretamente, substituir a água DI no banho com uma solução de banho (140 mM de hidróxido de potássio (KOH, M _r 56,1 g / mol), 20 mM 4 - (2-hidroxietil)-1-piperazineethanesulfonic ácido (HEPES, M _r 238,31 g / mol), 2 mM de cloreto de potássio (KCl, M _r 74,56 g / mol), pH é ajustado para 7,1-7,2 por metanosulfonico ácido (meso _3, M _r 96,1 g / mol)).

3. Patch clamping

1. Recobrimento do eletrodo de registro Ag com AgCl antes de cada patch clamping sessão. Primeiro, remova o fio de eletrodo do porta-pipeta e submergir o meia ponta do arame-eletrodo em um frasco contendo lixívia fresca pelo menos durante 15 minutos. Este depósitos uma camada de AgCl sobre o fio.
2. Lavar o arame eletrodo com água deionizada e secar. Em seguida, instalar o eletrodo Ag / AgCl de volta no suporte da pipeta.
3. Conecte o banho de eletrodo (referência) para o headstage e colocá-lo no banho. Isso prepara os eletrodos para gravação.
4. Agora preparar para aquisição de dados. Ligue o computador e ligue a chave de hardware na porta da impressora de seu computador. A chave de hardware deve ser ligada para que você use o software de aquisição de dados, que é Heka pulso.
5. Ligue o amplificador (Axon Instruments, AXOPATCH 200B) e começar a Heka Pulse. Carregar o arquivo de protocolo e ajustar as definições de configuração, tais como a Escala de estímulo. A meta para ajustar as definições de configuração é garantir que o potencial de teste é exatamente igual ao potencial de comando. Isso prepara o equipamento de aquisição de dados.
6. Prepare oócitos. Oócito submergir o stripping em solução (200 mM N-Metil-D-glucamina (NMG, M _r 195,22 g / mol), 200 mM Aspartato (sem K ⁺⁾ (M _r 133,1 g / mol), 2 mM de cloreto de potássio (KCl , M _r 74,56 g / mol), 10 mM de etileno glicol bis (2-aminoethylether)-N, N, N ', N'-tetraacetic ácido (EGTA, M _r 380,35 g / mol), 1 mM de cloreto de magnésio (MgCl ₂ • 6H ₂ O, M _r 203,31 g / mol), 10 mM 4 - (2-hidroxietil)-1-piperazineethanesulfonic ácido (HEPES, M _r 238,31 g / mol), pH é ajustado para 7,4 por hidróxido de sódio (NaOH, M _r 40,0 g / mol) por 5 -. 10 min A solução stripping destaca a membrana vitelina da membrana plasmática que torna possível para tirar a membrana vitelina.
7. Gentilmente tira a membrana vitelina do oócito usando dois pares de fórceps. Um ovócito devitellinized é extremamente frágil e, portanto, deve ser movido o mínimo necessário.
8. Tendo o cuidado de evitar expor o ovócito devitellinized ao ar ou bolhas, use uma pipeta de vidro preenchidos com solução suficiente para transferir o ovócito ao banho. Isso prepara o óvulo para a gravação.
9. Prepare pipetas patch. Puxe a pipetas de vidro após a inserção de um tubo de vidro capilar (VWR International, Cat # 53432-921) em um Sutter P-97 Flaming / Brown Micropipeta Puller. Observe as pipetas ao microscópio para determinar a forma da ponta e diâmetro de abertura. O diâmetro de abertura deve ser 2-4 micrômetros.
10. Para reduzir a corrente capacitiva durante a gravação e para garantir uma ponta lisa, o revestimento da ponta com cera e depois do fogo-polonês-lo.
11. Encha a ponta da pipeta, colocando a ponta da pipeta dentro da solução de pipeta (140 mM de hidróxido de potássio (KOH, M _r 56,1 g / mol), 20 mM 4 - (2-hidroxietil)-1-piperazineethanesulfonic ácido (HEPES, M _r 238,31 g / mol), 2 mM de cloreto de potássio (KCl, M _r 74,56 g / mol), 2 mM de cloreto de magnésio (MgCl ₂ • 6H ₂ O, M _r 203,31 g / mol), pH é ajustado para 7,1-7,2 por metanosulfonico ácido (meso _3, M _r 96,1 g / mol)) e desenho o êmbolo. Este molha a ponta.
12. Preencha pipeta 03/01 completa com pipeta solução utilizando uma seringa e coloque a pipeta no suporte da pipeta com a parte interna do eletrodo Ag / AgCl e entrar em contato com a solução da pipeta. Isto prepara a pipeta patch.
13. Para extirpar um patch de dentro para fora do oócito preparado, encontrar a clara vantagem do ovócito sob o microscópio. Mover a pipeta de patch perto do oócito usando manipulador. Anote a resistência série do pipeta. A resistência série ideal da pipeta patch é entre 1-1,5 mohms quando preenchido com solução de pipeta e submerso em solução de banho.
14. Empurre lentamente a pipeta contra o ovócito até a resistência aproximadamente dobra.
15. Aplicar sucção suave para a membrana por via oral, através de um tubo de sucção que é conectado ao titular da pipeta até um selo giga-ohm é obtido. Estabilizar o patch, segurando-o em tensão -30 mV para um par de minutos.
16. Para obter uma mancha de dentro para fora sobre o consumo, o patch rapidamente por empurrar a pipeta mais para o ovócito e, em seguida, puxando-o para fora.
17. O patch de dentro para fora agora está pronto para fixação. Mover a pipeta holding o patch de dentro para fora para cerca de 100 mícrons de distância da abertura da ponta de perfusão.
18. Fechar a válvula eletrônica para a recolha de resíduos e abrir a válvula do reservatório para a solução de perfusão desejado
19. Começar a gravar correntes em todo o patch. Mudar a tensão e soluções de perfusão, como desejado.
20. Quando você terminar a gravação, limpa a perfusão tubulações lápis, e empurrando a ponta através da água deionizada para evitar obstruções.

4. Resultados representante

Durante a preparação dos ovócitos para patch clamp, o tratamento 10/05 min de solução stripping seria separar a membrana vitelina da membrana plasmática, o que torna possível stripping a membrana vitelina.

A resistência série ideal da pipeta patch é entre 1-1,5 mohms quando preenchido com solução de pipeta e submerso em solução de banho.

Segue-se uma gravação representante de canais do tipo selvagem BK em um remendo de membrana de ovócitos. No canto superior esquerdo, as ondas quadradas indicam a tensão aplicada ao patch - a segunda etapa do aumentos de tensão de 50 mV a 200 mV com incremento de 50 mV. Abaixo está os traços correspondentes atuais, quando a solução de perfusão foi nominal 0 Ca ^{2 +} (livre [Ca ^{2 +]} é cerca de 0,5 nM). O emaumento da amplitude da corrente indica que a probabilidade de abrir canais BK aumenta com a tensão. No lado direito, o patch mesmo é perfundido com 1,0 mM Ca ^{2 +,} quando aplicado com o protocolo mesma tensão. A amplitude da corrente aumenta mais sob a mesma tensão, indicando que a probabilidade aumenta com open [Ca ^{2 +].}

Discussão

O sistema de expressão de ovócitos é ideal para a caracterização eletrofisiológica de canais voltagem-dependentes de íons devido ao fundo relativamente baixo de canais endógena. Além disso, uma vez que é um sistema de expressão transitória, ela fornece um método eficiente de realizar estudo de mutagênese destes canais. No entanto, deve-se notar que o sistema de expressão de ovócitos é diferente do que em células de mamíferos, assim, pode haver diferenças na modificação pós-traducional e associação com subunidades diferentes. Além disso, a concentração de lipídios pode variar entre as duas células que podem afetar as propriedades funcionais do canal.

Os tubos de perfusão, lápis e ponta deve ser limpo com água DI a cada vez após o experimento para evitar entupir. Sempre usar lixívia fresca para tratar o fio do eletrodo Ag ter certeza de que é revestido com AgCl, caso contrário a gravação será impreciso. Ajustar as definições de configuração para aquisição de dados para que o potencial de teste é exatamente igual ao potencial de comando. Seria útil para manter as pipetas correção limpa para usar uma tampa para protegê-los da terra e do fogo-polonês-los somente antes do uso.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Injetor de Auto-Nanolitro Nanoject II	Drummond Scientific	3-000-204
P-97 Extrator de Micropipeta Flamejante/Marrom	Sutter Instrument Co.	P-97
Sistema de Perfusão e Controlador Eletrônico	AutoMate Scientific, Inc.	ValveLink 16	Diâmetro interno da ponta de perfusão: 100 mícrons
Microscópio invertido	Olympus Corporation	CKX31
Pipetas de vidro	VWR international	53432-921
Extrator de micropipetas flamejantes/marrons	Sutter Instrument Co.	P-97
Amplificador	Axon Instruments	AXOPATCH 200B
Interface de Computador	INSTRUTECH Corporation	ITC-18
Headstage	Axon Instruments	CV 203BU