Grampo patch e Técnicas de Perfusão para estudar canais iônicos Expresso em Xenopus Oócitos

Resumo

Corrente iônica de canais BK é gravado usando técnicas de patch clamp. Canais BK são expressos em Oócitos Xenopus Através da injeção de RNA mensageiro. A solução intracelular durante gravações de patch clamp é controlado por um sistema de perfusão.

Resumo

O protocolo aqui apresentado foi concebido para estudar a ativação da condutância grande tensão e Ca ^{2 +-K +} ativados (BK) canais. O protocolo também pode ser usado para estudar a relação estrutura-função de canais iônicos e outros receptores de neurotransmissores ^1. Canais BK são amplamente expressos em diferentes tecidos e têm sido implicados em muitas funções fisiológicas, incluindo a regulação da contração do músculo liso, Afinação da frequência de células ciliadas internas e regulação da liberação de neurotransmissores ^2-6. BK canais são ativados por despolarização da membrana e por Ca ^{2 +} intracelular e Mg ^{2 + 6-9.} Portanto, o protocolo é projetado para controlar a tensão de membrana ea solução intracelular. Neste protocolo, o RNA mensageiro dos canais BK é injetado dentro de oócitos Xenopus laevis (estágio V-VI), seguido de 2-5 dias de incubação a 18 ° C ^10-13. Remendos da membrana que contêm um ou vários canais BK são excisadas com a configuração de dentro para fora usando técnicas de patch-clamp ^10-13. O lado intracelular do patch é perfundido com soluções desejadas durante a gravação de modo que a ativação de canais em diferentes condições podem ser examinados. Para resumir, o mRNA de canais BK é injetado dentro de oócitos Xenopus laevis para expressar proteínas canal na membrana do oócito; técnicas de patch clamp são usados ​​para gravar correntes que fluem através dos canais sob tensão controlada e soluções intracelular.

Protocolo

1. Injeção de mRNA em oócitos

1. Injetar 0,05-50 ng de RNA mensageiro que foi transcrita in vitro em oócitos Xenopus laevis (estágio V-VI), utilizando Nanoject II Auto-nanolitros Injector (Drummond empresa Scientific, modelo 3-000-204). Repetir a injecção em uma dúzia de ovócitos para cada mRNA.
2. Enxágüe os oócitos injetados duas vezes com solução ND-96 (96 mM de cloreto de sódio (NaCl, deputado 58,44 g / mol), 2 mM de cloreto de potássio (KCl, deputado 74,56 g / mol), 1,8 mM de cloreto de cálcio (CaCl ₂ • 2H ₂ O , o Sr. 147,02), 1 mM de cloreto de magnésio (MgCl ₂ • 6H ₂ O, o Sr. 203,31 g....

Discussão

O sistema de expressão de ovócitos é ideal para a caracterização eletrofisiológica de canais voltagem-dependentes de íons devido ao fundo relativamente baixo de canais endógena. Além disso, uma vez que é um sistema de expressão transitória, ela fornece um método eficiente de realizar estudo de mutagênese destes canais. No entanto, deve-se notar que o sistema de expressão de ovócitos é diferente do que em células de mamíferos, assim, pode haver diferenças na modificação pós-traducional e associação com subunidades difere.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Injetor Automático em Nanolitros Nanoject II	Drummond Scientific	3-000-204
Puxador de Micropipetas Flaming/Brown P-97	Sutter Instrument Co.	P-97
Sistema de Perfusão e Controlador Eletrônico	AutoMate Scientific, Inc.	ValveLink 16	Diâmetro interno da ponta de perfusão: 100 micrômetros
Microscópio Invertido	Olympus Corporation	CKX31
Pipetas de Vidro	VWR international	53432-921
Puxador de Micropipetas Flaming/Brown	Sutter Instrument Co.	P-97
Amplificador	Axon Instruments	AXOPATCH 200B
Interface de Computador	INSTRUTECH Corporation	ITC-18
Cabeçote	Axon Instruments	CV 203BU