Este protocolo detalhes como quantificar o número sinapse neuronal tanto na cultura dissociada e nas seções do cérebro utilizando imunocitoquímica. Usando compartimento de anticorpos específicos, nós rótulo terminais pré-sinápticos, bem como sites de especialização pós-sináptica. Nós definimos sinapses como pontos de co-localização entre os sinais gerados por estes marcadores.
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Artigo de método
Sinapses quantificar: um ensaio baseado em Imunocitoquímica para a quantificação do número Synapse
Neste artigo
Resumo
Resumo
Um dos objetivos mais importantes da neurociência é entender os sinais moleculares que instruem estágios iniciais da formação de sinapses. Como tal, tornou-se imperativo para desenvolver abordagens objetivo de quantificar alterações na conectividade sináptica. A partir de fixação da amostra, este protocolo detalhes como quantificar o número sinapse neuronal tanto na cultura dissociada e nas seções do cérebro utilizando imunocitoquímica. Usando compartimento de anticorpos específicos, nós rótulo terminais pré-sinápticos, bem como sites de especialização pós-sináptica. Nós definimos sinapses como pontos de co-localização entre os sinais gerados por estes marcadores. O número dessas colocalizations é quantificado através de um plug in puncta Analyzer (escrito por Bary Wark, disponível mediante solicitação, c.eroglu cellbio.duke.edu @), sob a plataforma de software de análise de ImageJ. O ensaio sinapse descritos neste protocolo pode ser aplicado a qualquer preparação de tecidos e cultura neural para o qual você tem seletiva marcadores pré-e pós-sináptica. Este ensaio sinapse é uma ferramenta valiosa que pode ser amplamente utilizada no estudo do desenvolvimento sináptica.
Protocolo
Soluções de Preparo:
- Tampão de anticorpos:
- 150 mM NaCl
- 50 mM Tris-Base (Fisher, Cat No:. BP152-5, 50 mM) - 1,21 g
- 1% BSA (Sigma, Cat No:. A2153, 1%) - 2,0 g
- 100 mM L-lisina (Sigma, Cat No:. L-1137, 100 mM) - 3,65 g
- Ajustar o pH para 7,4
- Azida 0,04%
- Ajustar o volume para 200 ml com água destilada H 2 O.
- Filtrar através 0.22μm filtro (Millipore, Cat No:. SCGPU02RE).
- PFA diluente:
- 168 ml 0,5 M Na 2 HPO 4 (dibásico)
- 72 ml 0,5 M Na 2 HPO 4 (monossódico)
- 660 ml H 2
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Discussão
O ensaio sinapse descrito acima é baseado no contexto de nossos objetivos experimental, no qual nos concentramos principalmente em projeções excitatórias do RGCs, seja na cultura ou purificada na seção cérebro. Nós fornecemos uma referência anticorpos tabela listando que funcionam bem para rotulagem sinapses excitatórias (Tabela 1).
Este ensaio sinapse pode ser adaptado para a quantificação do número sinapse de uma população neuronal ou qualquer outro subtipo sináptico para o qual existe um .......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Puncta Analyzer Plug-in para o Image J foi escrito por Barry Wark (endereço atual: Consultoria Physion) no laboratório de Ben A. Barres (Stanford University).
Financiamento;
- Alfred P. Sloan Foundation
- O A. Esther e José Klingenstein Fund, Inc.
- Fundação de Pesquisa Biomédica ampla
- Cura para a Iniciativa de Huntington s Disease
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Antígeno | Espécies | Monoclonais / policlonais | Vendedor | Número de catálogo | Diluição | Trabalha em Cultura | Obras nas Seções | |
| Pré-sináptica | Sinapsina | Coelho | Policlonal | Sistemas Synaptic | 106004 | 1:750 | Y | ND |
| Sinapsina | Mouse | Monoclonal | Sistemas Synaptic | 106001 | 1:500 | Y | Y | |
| Fagote | Mouse | Monoclonal | Designs ensaio | VAM-PS003F | 1:500 | Y | Y | |
| Fagote | Cobaia | Policlonal | Sistemas Synaptic | 141004 | 1:1000 | Y | ND | |
| Sinaptotagmina 1 | Coelho | Policlonal | Sistemas Synaptic | 105002 | 1:750 | Y | N | |
| Sinaptobrevina 2 (C1.69.1) | Mouse | Monoclonal | Sistemas Synaptic | 104211 | 1:500 | Y | Y | |
| Sinaptofisina (C1.7.2) | Mouse | Monoclonal | Sistemas Synaptic | 101011 | 1:500 | Y | Y | |
| VGlut1 | Mouse | Monoclonal | Millipore | MAB5502 | 1:2500 | N | Y | |
| VGlut1 | Cobaia | Policlonal | Millipore | AB5905 | 1:2500 | N | Y | |
| VGlut2 | Cobaia | Policlonal | Millipore | AB2251 | 1:2500 | N | Y | |
| Pós-sinápticos | PSD-95 (6G6 1C9-clone) | Mouse | Monoclonal | Afinidade Bio Reagentes | MA1-045 | 1:750 | Y | N |
| PSD-95 | Coelho | Policlonal | Zymed | 51-6900 | 1:500 | N | Y | |
| Pombo-correio | Mouse | Monoclonal | Sistemas Synaptic | 160011 | 1:500 | Y | ND | |
| Pombo-correio | Rato | Policlonal | Millipore | AB5875 | 1:500 | Y | Y | |
| Gephyrin | Coelho | Policlonal | Sistemas Synaptic | 147003 | 1:500 | Y | Y | |
| Gephyrin | Mouse | Monoclonal | Sistemas Synaptic | 147 | 1:200 | Y | Y |
Tabela 1: Lista de exemplos de bons marcadores pré-e pós-sinápticos que temos utilizado com sucesso em nosso ensaio sinapse. Estar ciente de que esta não é uma lista exaustiva de todos os marcadores disponíveis. Y = Sim, N = Não, ND = não determinado.
| Reagente | Companhia | Gato. Não. |
|---|---|---|
| PBS | Invitrogen | 20012-027 |
| poli-d-lisina | Sigma | P6407 |
| Laminina | Cultrex | 3400-010-01 |
| Triton X-100 | Roche Diagnostics Gmbh | 9002-93-1 |
| Soro normal de cabra | Gibco | 16210 |
| VectaShield com DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
| Outubro | Tissue-Tek | 4583 |
| Tris-Base (50 mM) | Pescador | BP152-5 |
| Albumina de soro bovino | Sigma | A2153 |
| l-lisina | Sigma | L-1137 |
| 16% de solução PFA | Microscopia Eletrônica de Ciências | 15711 |
| PFA granular | Microscopia Eletrônica de Ciências | 19210 |
| 24 poços placa de cultura | Falcão | 35-3047 |
| Anticorpos de cabra anti-camundongo conjugado Alexa | Invitrogen | --- |
| Fornecimento | Companhia | Gato. Não. |
| 12mm, n º 0 lamínulas de vidro | Karl Hecht Gmbh | 1105209 |
| No. 1,5 vidro lamela (para fatias) | VWR Scientific | 48393241 |
| Lâminas de vidro | VWR Scientific | 48311-703 |
Referências
- Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Y. Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning. Neuron. 1, 791-803 (1988).
- Meyer-Franke, A., Kaplan, M. R., Pfrieger, F. W., Barres, B. A.
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Reimpressões e permissões
