Análise de células-tronco pluripotentes usando criosecções dos corpos embrióides

Summary

Células-tronco pluripotentes de crescimento em suspensão se diferenciar em corpos embrióides (EBs). Aqui demonstramos como obter criosecções de alta qualidade EB útil para estudar os aspectos celulares e moleculares da embriogênese, preservando a sua organização como agregados.

Abstract

-Tronco embrionárias (ES) são células pluripotentes derivadas da massa celular interna do blastocisto estágio precoce de embriões de mamíferos ^1. A fase crucial na diferenciação de células-tronco embrionárias é a formação de corpos embrióides (EBs) agregados ^{2, 3.} EB formação é baseada na agregação espontânea, quando as células ES são cultivadas em placas não aderente. Recapitula tridimensional EB muitos aspectos da embriogênese de mamíferos cedo e se diferenciam em três camadas germinativas: ectoderma, mesoderma e endoderma ^4.

Imunofluorescência e hibridização in situ são amplamente utilizadas técnicas para a detecção de proteínas-alvo e mRNA presente nas células de uma secção de tecido ^{5, 6, 7.} Aqui nós apresentamos uma técnica simples para gerar criosecções alta qualidade dos corpos embrióides. Esta abordagem baseia-se na orientação espacial do EB incorporação em outubro seguido pela técnica cryosection. As seções resultante pode ser submetida a uma ampla variedade de procedimentos analíticos, a fim de caracterizar as populações de células que contêm certas proteínas, RNA ou DNA. Neste sentido, a preparação da EB criosecções (10μm) são ferramentas essenciais para análise histológica coloração (por exemplo, Hematoxilina e Eosina, DAPI), imunofluorescência (por exemplo, Oct4, nestina) ou hibridização in situ. Esta técnica pode também ajudar a compreender aspectos da embriogênese no que diz respeito à manutenção da estrutura tri-dimensional esférica de EBs.

Protocol

1. Fixação e Criopreservação

Células-tronco pluripotentes foram cultivados em fibroblastos de rato embrionárias (MEF) inativados com mitomicina C e mantidos em DMEM/F12 suplementado com a substituição knockout 20% de soro (KSR) e 8ng / mL do fator de crescimento de fibroblastos (FGF-2). , A fim de induzir a formação de células H9 EB foram transferidos para a não-aderente pratos e cultivadas por 7 dias, mantidos em DMEM/F12 suplementado com 15% KSR ^8.

Nota (!): Esta técnica pode ser usada para EBs derivado de uma célula embrionária e induziu-tronco pluripotentes.

1. Recolher as EBs da placa de cultura com um....

Discussion

O método descrito aqui fornece um fácil de seguir o protocolo para obter PFA seções fixas criostato fina de corpos embrióides útil para imunofluorescência e em ensaios de hibridização in situ. O criosecções resultando permitir o estudo de aspectos celulares e moleculares da embrionárias humanas diferenciação de células-tronco, preservando a sua estrutura e organização como agregados.

....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagente de Sacarose D (+)		Vetec	228
Reagente Paraformaldeído		Rieden-de Haë n	16005
PBS solução	Reagente	LGC Biotecnology	13-30259.05
Clomidrato de poli-L-lisina	Reagente	Sigma-Aldrich	P2636	200mg / mL em água
Tissue-Tek O.C.T. Reagente Composto		Sakura Finetek	P2636
Solução de sacarose	Reagente			10% Solução de sacarose em PBS w / v
Reagente			de solução de sacarose	20% Solução de sacarose em PBS com
reagente			de solução de sacarose	30% Solução de sacarose em PBS com v
Ferramenta de tubo cônico		Techno Plastic Products	91015	15mL tubo cônico
Ferramenta de agitador de placa		Biomixer
Ferramenta de criostato		Leica Microsystems	CM 1850
Molde para plataforma OCT	Ferramenta			Plataforma de molde de plástico