Rápida ciclagem térmica PCR usando convecção térmica em micro

Resumo

Descrevemos um novo método para realizar a replicação do DNA através da reação em cadeia da polimerase (PCR). Convecção térmica é aproveitada para reagentes shuttle continuamente entre desnaturação, anelamento e extensão através da manutenção de condições de superfícies opostas do reator a uma temperatura constante. Este projeto inerentemente simples promete fazer uma rápida PCR mais acessível.

Resumo

Muitos ensaios de biologia molecular dependem de alguma forma na reação em cadeia da polimerase (PCR) para amplificar uma amostra de DNA inicialmente diluir-alvo a um nível de concentração detectável. Mas o projeto de hardware convencional termociclagem PCR, predominantemente baseada em blocos de metal maciço aquecimento cuja temperatura é regulada por aquecedores termelétricas, limita severamente a velocidade de reação viável ^1. Considerável de energia elétrica também é necessário para repetidamente aquecer e resfriar a mistura de reagentes, limitando a capacidade de implantar estes instrumentos em um formato portátil.

Convecção térmica emergiu como uma abordagem promissora alternativa termociclagem que tem o potencial para superar essas limitações ^2-9. Fluxos convectivos são uma ocorrência diária em um diversificado leque de configurações que vão desde a atmosfera da Terra, oceanos e interior, para lâmpadas de lava decorativos e coloridos. Movimento fluido é iniciado da mesma forma que em cada caso: a instabilidade flutuabilidade impulsionado surge quando um volume confinado de fluido é submetido a um gradiente de temperatura espacial. Esses mesmos fenômenos oferecem uma maneira atraente para executar termociclagem PCR. Pela aplicação de um gradiente de temperatura estática através de uma geometria do reator adequadamente concebido, um fluxo contínuo do aparelho circulatório pode ser estabelecido que o transporte repetidamente reagentes PCR através de zonas de temperatura associadas com a desnaturação, anelamento, extensão e estágios da reação (Figura 1). Termociclagem pode ser acionado de forma pseudo-isotérmicas, simplesmente segurando duas superfícies opostas em temperaturas fixas, eliminando completamente a necessidade de repetidamente aquecer e resfriar o instrumento.

Um dos principais desafios de design de termocicladores convectivo é a necessidade de controlar com precisão a velocidade espacial e distribuições de temperatura dentro do reactor para assegurar que os reagentes seqüencialmente ocupam as zonas de temperatura correta para um período de tempo suficiente ^10,11. Aqui nós descrevemos os resultados de nossos esforços para investigar a velocidade 3-D cheio e distribuições de temperatura em microescala termocicladores convectivas ^12. Inesperadamente, descobrimos um subconjunto de trajetórias de fluxo complexos que são altamente favoráveis ​​para a PCR, devido a uma combinação sinérgica de (1) intercâmbio permanente entre os caminhos de fluxo que fornece uma oportunidade maior para os reagentes para experimentar toda a gama de perfis de temperatura ideal, e ( 2) aumento do tempo gasto dentro da zona de temperatura a taxa de extensão etapa limitante da PCR. Extremamente vezes DNA rápida amplificação (menos de 10 min) são realizáveis ​​em reatores projetados para gerar esses fluxos.

Protocolo

1. Projeto Básico do Termociclador por convecção

1. Temos construído um dispositivo simples termociclagem convectivas consistindo de plástico intercambiáveis ​​reação de câmara "cartuchos" que são colocados entre duas placas de alumínio, cuja temperatura é controlada de forma independente ⁷ (Figura 2).
2. Poços reator cilíndrico são incorporados por matrizes de usinagem de furos nos blocos de policarbonato, com diferentes combinações de diâmetro do furo e espessura da chapa de plástico utilizados para alcançar as proporções desejadas (altura / diâmetro = h / d). Duas geometrias diferentes reator são considerados nos resultados apresentados aqui: h / d = 9: h = 15.9 mm, d = 1,75 mm, volume de 38,2 mL; h / d = 3: h = 6,02 mm, d = 1,98 mm, 18,5 mL volume.
3. A superfície inferior do reator é aquecida através de um bloco de alumínio contendo aquecedores de cartucho de interface com um controlador de temperatura microprocesser conduzido.
4. A temperatura na superfície superior do reator é regulada através de um bloco de alumínio conectado a um banho de água de recirculação.
5. Todo o conjunto é preso em conjunto, utilizando parafusos de nylon para limitar a condução térmica entre os blocos de alumínio adversária.

2. Preparação e carregamento da mistura de reação de PCR

1. Um típico 100 mL mistura de reação contém 10 mL de solução-tampão 10x, 6 mL de 25 mM MgCl _2, 10 mL de dNTPs (2 mM cada), 41,2 mL de água DI, 10 mL de β-actina sonda, 10 mL de β -actina cartilha para a frente, 10 mL de β-actina primer reverso, 2 mL de DNA genômico modelo humano (10 ng / mL) e 0,8 mL de Kod DNA polimerase (2,5 unidades / mL).
2. Antes de carregar reagentes, selar a superfície inferior da câmara de PCR usando uma folha fina de fita de alumínio.
3. Lave os poços com um reator de 10 mg / ml de solução aquosa de albumina de soro bovino seguido por Rain-X Anti-Fog.
4. Reagentes pipeta no reator usando poços longo dicas gel de carregamento de pipeta e selar a superfície superior com fita Teflon FEP.

3. Executando a reação no termociclador por convecção

1. Antes de iniciar a reação, os blocos de pré-aquecimento de alumínio tanto para o desejado temperaturas da superfície superior e inferior.
2. Sandwich do reator de plástico carregado com PCR reagentes entre os blocos de aquecimento de alumínio, pinça e rapidamente a montagem em conjunto, utilizando parafusos de nylon.
3. Após a reação prosseguiu para o tempo desejado, desligue os aquecedores e coloque a superfície inferior (quente) do dispositivo em cima de um bloco de metal refrigerados rapidamente resfriá-lo e parar o fluxo convectivo.
4. Remova o reator de plástico e pipeta os produtos para fora dos poços (com as dicas de carga de longo gel) para posterior análise.

4. Realização de análise Eletroforese em Gel

1. Prepare a 2% em peso agarose gel por aquecimento de 10 g de agarose com 500 mL de tampão 1x em uma placa quente mexendo até que a solução se torna claro.
2. Carregar o gel agarose na bandeja de fundição e inserir o pente. Deixe o conjunto de gel para ~ 30 min.
3. Retirar o pente e adicionar tampão TAE 1x até que o gel está submerso.
4. Fluorescente amostras de DNA manchado conter 2 mL 100x SYBR Green solução I, 2 mL de amostra de DNA, 2 mL Dye Carregando 6x Orange, e 4 tampão TAE mL.
5. Adicionar as amostras de DNA para os poços e executar a separação em 60 V para 1 h com uma bp DNA ladder 100 marcador de dimensionamento.
6. Remover o gel e fotografá-lo sob a luz UV para obter o resultado.

5. Resultados representativos:

Projeto ótimo de termocicladores convectivas envolve a escolha correta da geometria do reator que irá gerar um fluxo circulatório capaz de transportar os reagentes através da chave temperaturas envolvidas no processo de PCR. Os parâmetros geométricos que podem ser variadas nos reatores cilíndricos aqui considerados são a altura (h) e diâmetro (d), ou equivalentemente a proporção (h / d). Nós exploramos os campos 3-D do fluxo dentro convectivas reatores PCR em um intervalo de proporções diferentes, utilizando dinâmica de fluidos computacional (CFD), e descobriram que os padrões complexos podem surgir inesperadamente. Mais importante ainda, nossa análise revelou um subconjunto desses campos fluxo complexo que acelerar significativamente a reação ^12.

Estes efeitos geométricos podem ser vistos claramente, comparando os campos de fluxo em reatores em proporções altas e baixas. No caso de alta proporção (h / d = 9; um cilindro alto e magro), elementos de fluido são advected ao longo de trajetórias traçando caminhos que são essencialmente fechado loops, e eles são locked-in para seguir os mesmos caminhos por longos períodos de tempo (Figura 3a). Conseqüentemente, há pouca oportunidade de intercâmbio entre ftrajetórias baixo que exponha os reagentes para a seqüência ideal de condições térmicas para a PCR (oscilando entre o recozimento e desnaturação extremos em superfícies superior e inferior do reator) eo conjunto muito maior de trajetórias restantes que não contribuem para a amplificação (localizada mais perto do centro do reator).

O campo de fluxo é muito diferente em uma proporção menor de aspecto (h / d = 3; um curto cilindro, mais amplo), tornando-se mais caótica no sentido de que as trajetórias elemento de fluido não seguem caminhos fechados (Figura 3b). Assim, embora os reagentes são submetidos a um perfil de temperatura mais complexos, os elementos fluidos são capazes de explorar uma gama muito maior de trajetórias para que mais do volume de reagente tem uma ótima oportunidade de experimentar perfis térmicos. Estes resultados sugerem que, embora contraintuitivamente trajetórias de fluxo individuais em h / d = 09 de maio parecem ser mais favoráveis ​​para a PCR, produzindo perfis de temperatura que "olhar" similares aos empregados em um termociclador convencional, a natureza caótica do campo de fluxo em h / d = 3, em última análise domina em uma escala global, promovendo maior intercâmbio para que os reagentes não ficam presas em trajetórias desfavoráveis ​​por muito tempo.

Para testar essa hipótese e determinar qual a geometria do reator foi mais favorável para a PCR, usamos os dois para realizar a replicação PCR de um alvo de 295 bp associado com o gene β-actina de um modelo de DNA genômico humano. Notavelmente, rotineiramente alcançados amplificação do produto alvo correto em apenas 10 min em h / d = 3 (Figura 4a), enquanto a mesma reação necessários pelo menos 20 minutos antes de os produtos detectáveis ​​foram observadas em h / d = 9 (Figura 4b) . A especificidade de reação também é muito maior em h / d = 3, onde um produto PCR simples é obtido, enquanto vários produtos inespecíficos são gerados em h / d = 9, onde as armadilhas do fluxo líquido no campo de elementos desfavoráveis ​​trajetórias térmica por longos períodos de tempo.

Figura 1. Convecção térmica em uma câmara cilíndrica, cuja parte superior e inferior superfícies são mantidas em diferentes temperaturas fixas. Se a temperatura na superfície inferior é maior do que no topo, um gradiente de densidade vertical é estabelecida dentro do fluido fechado que é capaz de gerar um padrão de fluxo circulatório. Com a escolha certa de parâmetros geométricos (altura e diâmetro d h), o campo de fluxo convectivo pode ser aproveitada para accionar termociclagem PCR quando as superfícies superior e inferior são manintained perto recozimento e temperaturas de desnaturação, respectivamente (a gravidade atua verticalmente para baixo).

Figura 2. (A) Os principais componentes de um fluxo de convecção PCR thermocyler. Um cartucho de reator consiste de um bloco de policarbonato contendo um conjunto de câmaras cilíndricas. O bloco está entre uma placa superior projetado para ser conectado a um banho de água circulante e uma placa inferior incorporando aquecedores embutidos. (B) Os reagentes PCR são carregados e lacrados dentro do cartucho do reator, após o qual o dispositivo é montado para realizar a reação. Após a conclusão, o procucts pode ser facilmente pipetado para análises posteriores.

Figura 3. Simulações computacionais de 3-D campos fluxo convectivo gerado dentro de reatores cilíndricos com temperaturas de 53 e 96 ° C impostas nas superfícies superior e inferior, respectivamente. Resultados são mostrados na razão de aspecto de (a) h / d = 9 (38,2 mL de volume do reator) e (b) h / d = 3 (18,5 mL de volume do reator). A trajetória representante seguido por um elemento fluido viajar através do campo de fluxo 3D é mostrado à esquerda junto com projeções vista superior e lateral do caminho; a trama correspondente da temperatura versus tempo após um elemento de fluido é mostrado à direita. O perfil térmico em 9 = h / d aparece próximo ao de um termociclador convencional, mas o campo de fluxo caótico, 3 = h / d é contraintuitivamente mais favorável para PCR.

Figura 4. DNA replicação resultados obtidos nas geometrias reator mostrado na Figura 3 (superior e inferior superfícies foram mantidas em 53 e 96 ° C, respectivamente). (A) PCR é muito acelerado, 3 = h / d, como é evidente pelos produtos fortes visível após apenas 10 min de tempo de reação (M: 100 bp ladder, faixas 1-4: produtos de reações paralelas em 4 diferentes câmaras cilíndricas). (B h / d exige pelo menos 20 minutos antes de os produtos visíveis são observadas, e várias bandas estão indicando replicação evidente de não-específica do DNA alvo, além do produto desejado (M: 100 bp ladder, faixas 1-2: produtos de reações paralelas em duas diferentes câmaras cilíndricas).

Discussão

A interação entre fluxo e reação química pode mudar drasticamente sob a influência da advecção caótica. Mas estes estados de fluxo complexos são difíceis de estudar, principalmente em geometrias realista, onde os efeitos 3D tornar-se importante. Rayleigh-Bénard convecção em h / d> 1 não só fornece uma plataforma conveniente para explorar esses fenômenos, a sua aplicação para realizar PCR também permite o acoplamento entre o fluxo e reações químicas a ser sondado. Esta capacidade única faz com que seja possível selecionar os estados fluxo ideal onde atuam efeitos caóticos (contraintuitivamente) para acelerar a taxa de replicação do DNA.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit de Polimerase KOD DNA	Novagen, EMD Millipore	71085-3
Kit de Reagentes Controle TaqMan β-actina	Applied Biosystems	401846
Fita de alumínio	Axygen Scientific	PCR-AS-200
Albumina sérica bovina	Sigma-Aldrich	A2153
Rain-X Antiembaçante	SOPUS Products
Pontas de pipeta longas para carregamento de géis	Fisher Scientific	05-408-151
Fita de Teflon FEP	McMaster-Carr	7562A17
Gel de agarose	Bio-Rad	161-3107
Tampão de corrida TAE	Bio-Rad	141-0743
SYBR Green I	Invitrogen	S7563
Corante de carregamento laranja 6x	Fermentas	R0631
Marcação de tamanho com marcador de DNA de 100 pb	Bio-Rad	170-8202