Aqui demonstramos um protocolo para realizar a coloração de células vivas que podem ser usados para detectar receptores olfativos na superfície de células HEK293T convenientemente. Além disso, ele também pode ser usado para ensaio para a expressão de outros receptores de superfície chemosensory ou GPCRs.
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Artigo de método
Assaying Expressão de Receptores de superfície chemosensory em células heterólogas
Neste artigo
Resumo
Resumo
O mundo vívido de odores é reconhecida pelo senso de olfato. Olfato em ratos é mediada por um repertório de cerca de 1.200 receptores de proteína G acoplada (GPCRs) 1, que são postulados para ligar moléculas de odores voláteis e converter o sinal extracelular em um sinal intracelular por acoplamento com a proteína G Gαolf. Vinculativa da odorants aos receptores é pensado para seguir uma regra combinatória, isto é, um odorante pode ligar vários receptores e um receptor pode ligar vários odores, em diferentes graus 2. Sinalização, bioquímicos e estudos de ligação ligante foram convenientemente realizados para a maioria dos GPCRs usando células heterólogas. Contudo, o uso de células heterólogas para estudo de receptores olfativos, foi impedido por um longo tempo desde a transfecção eles falharam a exportar para a superfície. Saito et al demonstraram Receptor única passagem de transporte da proteína de membrana (RTP) chaperones família mostram maior expressão nos neurônios sensoriais olfativos e atuam como chaperones aos receptores olfativos do tráfego para a superfície em células heterólogas, quando co transfectadas juntos 3. Para realizar ensaios bioquímicos para os receptores usando células heterólogas, é preciso primeiro determinar se o receptor mostra a expressão na superfície robusta na linhagem celular. Isto pode ser analisada pela superexpressão de receptores com o RTP1S chaperone seguido por células vivas coloração fluorescente para rotular o domínio extracelular ou um tag no domínio extracelular exclusivamente. Aqui demonstramos um protocolo para realizar a coloração de células vivas que podem ser usados para detectar receptores olfativos na superfície de células HEK293T convenientemente. Além disso, ele também pode ser usado para ensaio para a expressão de outros receptores de superfície chemosensory ou GPCRs.
Protocolo
1. Procedimento:
O procedimento é composto de três partes concluídas ao longo de um tempo total de três dias: as células de transferência, transfecção e imunocitoquímica, um passo realizadas por dia. Transferência e transfecção de células ao longo dos dois primeiros dias devem ser realizados em condições estéreis em câmara de fluxo laminar.
Dia 1: Transferência de células HEK293T para ensaio de expressão de superfície.
- Transferência média (M10): Mix meio essencial mínimo suplementado com 10% (em volume) de soro fetal bovino em condições estéreis.
- Cultivar células a uma confluência desejada em....
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Discussão
Cada etapa deve ser realizada com cuidado para garantir manchas na superfície proeminente e distintivo. O processo de coloração inteira deve ser realizado em frio (no gelo), ea bandeja na qual são colocadas lamínulas deve ser resfriado antes de ser utilizado para garantir células permanecer vivo. Além disso fixação é feito no final do processo de manchas na superfície. Isto está em nítido contraste com a coloração interna, onde a fixação precede coloração para permeabilizar a membrana celular dos anticorpos primário e s.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Agradecemos aos membros da Matsunami laboratório para leitura crítica deste manuscrito.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Lâmina de cobertura 22 X 22 mm (#1) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 72200-11 | |
| Soro bovino fetal | GIBCO, por Life Technologies | 16000 | |
| Lipofectamina 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Meio mínimo essencial | Sigma-Aldrich | M4655 | Com L-glutamato, sal de Earle’s e bicarbonato |
| Mowiol | Calbiochem | 475904 | |
| Paraformaldeído | EMS | 19208 | |
| Solução Salina Balanceada de Hanks (HBSS) 1X | GIBCO, por Life Technologies | 14025 | Com cloreto de cálcio e cloreto de magnésio |
| Solução tampão HEPES | GIBCO, por Life Technologies | 15630 | |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | Sem cálcio e magnésio |
| Poli-D-lisina hidrobrometo | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Azida de sódio | Electron Microscopy Sciences | SX0299-1 | |
| Placa de cultura celular 35 X 10 mm | Falcon BD | 353801 | |
| Tripsina-EDTA | GIBCO, por Life Technologies | 25300 | 0,05% |
Referências
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65, 175-187 (1991).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96, 713-723 (1999).
- Saito, H.....
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Reimpressões e permissões
