Os autores não têm nada a declarar.

neurogênese cortical: transição do avanços no laboratório de terapias baseadas em células

Cortical Neurogenesis: Transitioning from Advances in the Laboratory to Cell-Based Therapies

Neurogênese cortical: Transição do Avanços no Laboratório de terapias baseadas em células

Meu nome é Arnold Krickstein. Sou o diretor do Instituto de Medicina Regenerativa aqui na UCSF, e minha área de interesse é a neurobiologia do desenvolvimento. Especificamente, estamos muito interessados nos estágios iniciais do desenvolvimento cortical e temos investigado células-tronco e progenitoras neurais, estudando como elas geram neurônios e como esses neurônios migram e começam a formar circuitos no cérebro em desenvolvimento, especialmente na córtex.Bem, o advento da eletroporação in utero, penso eu, tem sido uma dessas tecnologias transformadoras introduzidas por SDO e seus colegas no estudo dos estágios iniciais do desenvolvimento cerebral, pois isso permite realizar experimentos de ganho e perda de função para uma grande variedade de genes. E fazê-lo de forma relativamente simples, introduzindo esses genes diretamente nas células-tronco neurais e células progenitoras que geram neurônios durante o desenvolvimento cortical inicial. A técnica envolve basicamente injetar DNA na forma de um plasmídeo nos ventrículos cerebrais de um animal em estágio embrionário e, em seguida, aplicar uma corrente elétrica breve que direciona esses plasmídeos para as células que revestem o ventrículo, ou seja, as células do tipo neuroepiteliais radiais gliais, que posteriormente produzem neurônios e, eventualmente, células gliais.E isso pode incluir o uso de RNAs interferentes curtos que podem reduzir ou silenciar a expressão de genes específicos, ou você pode superexpressar diretamente produtos gênicos particulares. Ambos os conjuntos de experimentos analisam efeitos complementares no cérebro em desenvolvimento. As moléculas-alvo podem incluir praticamente qualquer elemento envolvido nas fases iniciais do desenvolvimento cerebral ou mesmo em estágios posteriores do desenvolvimento ou maturação sináptica.O advento dessa técnica já teve um grande impacto nos estudos do cérebro em desenvolvimento e promete causar um efeito ainda maior no futuro próximo. As células que revestem o ventrículo e que, em última instância, originam todos os neurônios e as células gliais no cérebro começam como células neuroepiteliais. Porém, por volta do momento em que os neurônios começam a se desenvolver, elas se transformam ou iniciam a transformação em um tipo de célula glial conhecido como célula glial radial.Eles estabelecem contatos especializados com vasos sanguíneos e orientam a migração de neurônios jovens. E, por volta desse período, começam a realizar um conjunto interessante de diferentes tipos de divisões. Eles realizam um tipo de divisão de progenitor simétrica ao produzir mais cópias de si mesmos, ou seja, geram duas células gliais radiais a cada divisão.Eles também realizam divisões neurogênicas assimétricas, nas quais se dividem e se autorrenovam, gerando em cada ciclo celular uma célula-filha que se torna um neurônio. Mas também se verifica que eles realizam um terceiro tipo muito interessante de divisão, que é assimétrica no sentido de que as células-filhas são diferentes. Uma delas é uma célula glial radial autorrenovada e a outra se torna um tipo diferente de célula progenitora.Denominamos esse tipo um progenitor intermediário que migra para longe do ventrículo e então se divide geralmente em uma zona proliferativa diferente conhecida como zona subventricular. O método de eletroporação intraútero é uma maneira conveniente de introduzir esses DNAs de silenciamento ou superexpressão nas células gliais radiais durante os estágios em que elas estão realizando esses diferentes tipos de divisão. Também temos utilizado um retrovírus que expressa a proteína verde fluorescente como marcador de linhagem, uma forma de injetar esse marcador de retrovírus nos ventrículos dessas mesmas idades e, então, podemos acompanhar o destino dessas células individualmente marcadas à medida que se dividem e geram clones de células filhas.E, por meio de imagens de lapso de tempo obtidas em culturas de fatias, podemos acompanhar ou rastrear os destinos finais dessas células enquanto migram para o córtex. Embora por algum tempo se tenha pensado que a zona ventricular era a principal fonte de neurogênese no cérebro em desenvolvimento, a zona subventricular passou a ser, pelo menos no embrião, cada vez mais reconhecida como uma fonte significativa de neurogênese. E descobrimos que, na zona subventricular, os progenitores intermediários, que por sua vez surgem dos radicoglias na zona ventricular, migram para lá e se dividem de maneira simétrica, gerando ou mais progenitores intermediários autorrenováveis ou, em uma divisão terminal simétrica, pares de neurônios que então migram para o córtex.Assim, a zona subventricular está se revelando uma região muito importante e interessante de neurogênese no cérebro embrionário ou em desenvolvimento. Além disso, essas células progenitoras intermediárias, enquanto permanecem na zona subventricular, tornam-se células multipolares e parecem ter a capacidade de se mover tangencialmente dentro dessa zona. Isso pode explicar a dispersão de clones celulares observada em estudos anteriores, por exemplo, por Walsh e S Cepco há algum tempo no córtex em desenvolvimento, utilizando também retrovírus para marcar os destinos dessas células.Bem, por exemplo, há uma série de genes interessantes que estão envolvidos, como se descobriu, na neurogênese ou na migração neuronal. Em nosso laboratório, estudamos as proteínas das junções comunicantes, as conexões que sustentam a formação dos bem conhecidos canais de junções comunicantes. Mas, de forma interessante, descobrimos que as células que migram ao longo dos glias radiais estão utilizando essas junções comunicantes não como canais de comunicação, mas como moléculas de adesão para permitir fisicamente que os neurônios e as células migratórias adiram às fibras radiais.E esses estudos foram na verdade realizados utilizando siRNAs que reduziram a expressão de conexões específicas. Por exemplo, a conexão 43, que é altamente expressa pelos ggl radioativos e também por seus neurônios filhos e por suas células progenitoras intermediárias. Muitas das chamadas células-tronco adultas que derivam do cérebro fetal, na verdade, provavelmente são células radioativas que podem ser expandidas em cultura quando tratadas com os fatores de crescimento adequados, como o BFGF, por exemplo.Mas além dessas células gliais radiais, os progenitores intermediários podem revelar-se um alvo muito interessante para a pesquisa com células-tronco, porque acreditamos que elas efetivamente produzem neurônios de um tipo celular muito restrito. Assim, se uma estratégia envolver, por exemplo, a criação de grandes quantidades de um tipo celular neuronal muito específico, a capacidade de identificar e isolar as células progenitoras intermediárias responsáveis pela geração desse tipo celular particular provavelmente seria uma abordagem muito melhor do que, por exemplo, criar grandes quantidades de células gliais radiais, que poderiam produzir uma grande variedade de tipos celulares diferentes. De fato, em estudos realizados in vitro, quando se expandem linhagens de células-tronco embrionárias e depois se geram neurônios individuais a partir dessas fontes de células-tronco embrionárias, parece que a maioria dessas linhagens passa por um estágio que pode até ser obrigatório, semelhante a um epitélio ou a células gliais radiais, antes de efetivamente gerar neurônios.Por exemplo, os protocolos utilizados por Austin Smith para gerar neurônios ou células-tronco neurais são, na verdade, muito semelhantes aos dos gliócitos radiais. Eles passam por migração nuclear cinética. Eles expressam fatores de transcrição e marcadores de gliócitos radiais, e geram neurônios e astrócitos de maneira muito semelhante à dos gliócitos radiais.E, de forma semelhante, Loren Ser e outros pesquisadores utilizaram células-tronco embrionárias humanas e descobriram que elas formam rosáceas, ou seja, se auto-organizam em uma estrutura do tipo neuroepitelial em cultura, in vitro, antes mesmo de gerar neurônios. E, novamente, essas rosáceas são compostas por células que se assemelham muito às glia radiais. Assim, a ideia de que essas glia radiais são um tipo de célula-tronco neural, creio eu, é apoiada por esse tipo de evidência in vitro.Assim, antes do início da neurogênese, já ocorre um padrão regional ao longo da zona ventricular em todos os ventrículos e, de fato, em toda a extensão da medula espinhal. E esses genes de padronização que são expressos em regiões específicas provavelmente já restringem os destinos das células-filhas produzidas nesses locais. Por exemplo, se você desejar gerar células parametálicas excitatórias, os glioblastos corticais dorsais produzem esse tipo celular; se quiser produzir interneurônios, então talvez precise usar as células da eminência ganglionar, que geram esses interneurônios ou oligodendrócitos, e assim por diante.E assim, se sua estratégia na pesquisa com células-tronco, em termos de tratamento de uma doença, envolver a criação de grandes quantidades de células de um tipo específico, como um certo tipo de interneurônio ou um determinado tipo de célula projetora excitatória, então estudos do desenvolvimento que estão começando a revelar as diferenças entre a neurogênese e essas distintas regiões cerebrais diferentes provavelmente fornecerão pistas que, em última instância, poderão ser utilizadas para elaborar estratégias de expansão de neurônios de um tipo celular específico, por exemplo, para terapias com substituição de células. Bem, a terminologia de regeneração ou medicina regenerativa realmente sugere a capacidade de regenerar órgãos. E acho que a maioria do público pensa nas células-tronco como um método para substituir células e tecidos lesionados.Mas, na verdade, acredito que os primeiros tratamentos que provavelmente surgirão da pesquisa com células-tronco envolverão o uso dessas células de outras formas, talvez mais criativas. Por exemplo, a utilização da pesquisa com células-tronco em laboratório, permitindo a triagem de fármacos por métodos de alto rendimento para modelar doenças usando células humanas em vez de células de camundongo em laboratório. E, em termos de terapias celulares, penso que, em grande parte — na verdade, acho que já começou a ser usado — como um veículo de entrega, aproveitando, por exemplo, a capacidade de certas células-tronco de migrar para áreas de lesão ou doença e entregar uma carga, seja um gene, um produto gênico ou uma enzima ausente, entre outros.Essa aplicação que não envolve a integração das células em estruturas orgânicas pré-existentes, creio eu, representa um objetivo mais acessível. E talvez alguns dos primeiros exemplos de terapias celulares envolvam essa abordagem, em vez da substituição celular propriamente dita. Bem, as atuais restrições federais sobre o uso de verbas do NIH para qualquer célula-tronco embrionária humana além de um pequeno número já aprovado tiveram um efeito desestimulante significativo sobre a área.Isso afastou alguns pesquisadores jovens do campo e impediu que outros explorassem efetivamente a utilidade potencial dessas células-tronco embrionárias no laboratório. Houve tentativas de tentar liberalizar essas restrições. Como a maioria dos seus espectadores provavelmente sabe, o presidente vetou um projeto de lei e provavelmente, desculpe, está prestes a vetar outro.Nossa expectativa é que essas políticas mudem e que se torne possível utilizar financiamento do NIH para estudar uma ampla gama de linhagens de células-tronco recém-desenvolvidas, muitas das quais apresentam vantagens em relação àquelas linhagens originais criadas antes de 2001. Mas mesmo que essa proibição de financiamento seja revogada, provavelmente não resultaria imediatamente, pelo menos, em um aumento de financiamento para esse tipo de pesquisa. E como este projeto de lei, por exemplo, proposto no Congresso, não é um projeto de financiamento ou de dotação orçamentária, ele terá impacto ao facilitar que pesquisadores como nós incorporem trabalhos com linhagens chamadas aprovadas e não aprovadas no mesmo espaço de pesquisa, no mesmo laboratório, utilizando os mesmos equipamentos ou compartilhando alguns dos mesmos recursos.Tudo isso seria uma grande melhoria, mas é improvável que resulte em um grande influxo de apoio efetivo, na forma de verbas de pesquisa para esse tipo de atividade. E para isso, acredito que ainda teremos de depender de fontes privadas, incluindo o financiamento estadual, que aqui na Califórnia é realmente um benefício para pesquisadores na área de células-tronco, além da Califórnia. Outros estados, como Nova York, Connecticut e Massachusetts, também estão seguindo esse exemplo e em breve financiarão suas próprias iniciativas estaduais para pesquisa em células-tronco.E acho que isso será um motor importante para impulsionar a pesquisa nessa área praticamente em todo o futuro previsível, independentemente de a política do NIH mudar em breve ou não.

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