Uma nova abordagem que permite a resolução de alta análise das interações de células de câncer com ácido hialurônico exógeno (HA) é descrita. Superfícies padronizadas são fabricados através da combinação química carbodiimida e impressão microcontact.
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Artigo de método
Superfícies micropatterned para estudar as interações ácido hialurônico com células de câncer
Neste artigo
Resumo
Resumo
Invasão e progressão do câncer envolve um fenótipo de células móveis, que está sob regulamentação complexa por fatores de crescimento / citocinas e da matriz extracelular (ECM) componentes dentro do microambiente do tumor. Ácido hialurônico (AH) é um componente ECM estroma que é conhecido para facilitar a progressão do tumor pela invasão melhoria, crescimento e angiogênese 1. Interação da HA com o seu celular CD44 receptor de superfície induz sinalização eventos que promovem o crescimento de células tumorais, sobrevivência e migração, aumentando assim a propagação metastática 2-3. HA é um glicosaminoglicano, aniônicos nonsulfated composto por unidades repetitivas de ácido D-glucurônico e DN-acetilglucosamina. Devido à presença de grupos carboxila e hidroxila em unidades de dissacarídeo repetindo, HA nativa é em grande parte hidrofílica e passíveis de modificações químicas que introduzem grupos sulfato para imobilização photoreative 4-5. Estudos anteriores envolvendo a imobilização de HA em superfícies utilizam o comportamento bioresistant da HA e seu derivado sulfatado para controlar a adesão celular em superfícies 6-7. Nestes estudos de adesão celular ocorre preferencialmente em regiões não-HA padronizadas.
Para analisar as interacções celulares com HA exógeno, desenvolvemos padrões superfícies funcionalizadas que permitam um estudo controlado e de alta resolução de visualização das interações de células cancerosas com HA. Utilizamos a impressão microcontact (UCP) para definir padrões discretos regiões de HA em superfícies de vidro. A "tethering" abordagem que se aplica a química carbodiimida ligando para imobilizar o AH foi utilizado 8. Superfícies de vidro foram microcontact impressos com uma aminosilane e reagiu com uma solução de HA de rácios otimizada de EDC e NHS para habilitar imobilização HA em matrizes padronizadas. Incorporando a química carbodiimida com MCP permitiu a imobilização de HA para regiões definidas, criando superfícies adequadas para aplicações em vitro. Ambas as células de câncer de cólon e células de câncer de mama implicitamente interagiram com as superfícies HA micropatterned. Adesão célula cancerosa ocorreu dentro de 24 horas com a proliferação por 48 horas. Utilizando superfícies HA micropatterned, demonstramos que a adesão de células cancerosas ocorre através do receptor CD44 HA. Além disso, as superfícies HA padronizadas eram compatíveis com microscopia eletrônica de varredura (MEV) e resolução de imagem permitiu elevado de câncer de saliências adesivas celular e espalhar sobre os padrões de HA para analisar a motilidade de células cancerosas em HA exógeno.
Protocolo
1. Fotolitos padrão para micropatterned Fabricação Stamp
- Enxágüe um wafer de silício novo com etanol e seco com fluxo de ar. Use uma pinça para manusear wafer e prevenir defeitos de superfície durante todo o processo.
- Transferência de wafer para girar aplicador e tampa superfície do wafer com SU-2025 fotorresiste negativo. Cobrir pelo menos 80% de wafer com fotorresiste. Casaco giro por 10 segundos a 600rpm, seguido por 30 segundos a 3000rpm. Devido à fotossensibilidade do fotorresiste, desligar luzes da sala a partir deste ponto em diante.
- Transferência de fotorresiste wafer de silício revestido de chapa quente para "soft-assar" a 95 °....
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Discussão
O método apresentado micropatterning HA permite o estudo das interações celulares com HA exógeno. HA é conhecida por desempenhar um papel fundamental na progressão do câncer 1 no entanto tem havido estudos limitados a investigar a interação de células de câncer em duas dimensões superfícies HA padronizadas. Um estudo controlado sobre micropadrões exógenos HA permite a visualização de alta resolução de adesão de células cancerosas, crescimento e migração e pode elucidar ainda mais os fundamentos de câncer.
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Divulgações
Figura esquemática de vídeo reproduzido com permissão; Direitos Autorais Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Dickinson LE, Kusuma S, Gerecht S. Reconstruindo o nicho de diferenciação das células-tronco embrionárias usando biomateriais. Macromol. Biosci. 2010; 21 de outubro. [Epub ahead of print].
Agradecimentos
Os autores reconhecem o uso do laboratório de análise de superfície na Universidade Johns Hopkins, financiado, como parte da Pesquisa em Ciências Materiais e Centro de Engenharia através da National Science Foundation. LED é um estagiário e um IGERT National Science Foundation Graduate Fellow. Esta pesquisa foi parcialmente financiado pelo NIH conceder U54CA143868.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Fotolito SU-2025 | MicroChem Corp. | Y111069 | |
| Desenvolvedor SU-8 | MicroChem Corp. | Y020100 | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| 3-aminopropiltrimetoxissilano (APTMS) | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| 2-[metoxi(polietilenoxi)propil]trimetoxissilano (Peg-silano) | Gelest Inc. | SIM6492.7 | |
| 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22980 | |
| N-hidroxissuccinimida (NHS) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 24500 | |
| Ácido hialurônico marcado com fluoresceína (FL-HA) | Sigma-Aldrich | F1177 | Reconstituir com 10 ml de água desionizada |
| Células de carcinoma de mama MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
| Células de carcinoma de cólon LS174t | ATCC | Cl-188 |
Referências
- Toole, B. P., Wight, T. N., Tammi, M. I. Hyaluronan-cell interactions in cancer and vascular disease. Journal of Biological Chemistry. 277, 4593-4596 (2002).
- Hamilton, S. R. The Hyalur....
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Reimpressões e permissões
