A estimulação mecânica de Células-Tronco Usando Strain Uniaxial Cíclico

Resumo

É amplamente entendido que forças mecânicas no corpo pode influenciar a diferenciação e proliferação celular. Aqui apresentamos um protocolo de vídeo demonstrando o uso de um biorreator custom-built para a entrega de deformação de tração uniaxial cíclicos às células-tronco cultivadas em substratos flexíveis micropatterned.

Resumo

O papel das forças mecânicas no desenvolvimento e manutenção dos tecidos biológicos é bem documentado, incluindo vários fenômenos mecanicamente regulamentadas, tais como remodelação óssea, hipertrofia muscular, e da plasticidade das células musculares lisas. No entanto, as forças envolvidas são extremamente complexas e difíceis de monitorar e controlar in vivo. Para melhor investigar os efeitos de forças mecânicas sobre as células, nós desenvolvemos um método in vitro para a aplicação de deformação de tração uniaxial cíclicos de células aderentes cultivadas em membranas elásticas. Este método utiliza um biorreator personalizados com um sistema motorizado cam-rotor para aplicar a força desejada. Aqui apresentamos um protocolo de vídeo passo-a-passo demonstrando como montar os vários componentes de cada "câmara de estiramento", incluindo, neste caso, uma membrana de silicone com micropatterned topografia para orientar as células com a direção da tensão. Descrevemos também procedimentos para a esterilização das câmaras, a semeadura em células da membrana, trancando a câmara para o biorreator, e ajustando os parâmetros mecânicos (ou seja, magnitude e taxa de deformação). Os procedimentos descritos neste protocolo particular, são específicos para a semeadura de células-tronco mesenquimais em membrana de silicone com 10 mM canais amplo orientado paralelamente à direção de tensão. No entanto, os métodos e materiais apresentados neste sistema são flexíveis o suficiente para acomodar uma série de variações sobre este tema: taxa de deformação, magnitude, duração, tipo de célula, topografia de membrana, revestimento de membrana, etc podem ser adaptados para a aplicação desejada ou resultado. Este é um método robusto para investigar os efeitos da deformação de tração uniaxial aplicada às células in vitro.

Protocolo

Dia 0 - Esterilização antes do dia de experimento

1. Colocar materiais em tubo de plástico e esterilizar com álcool 70% durante 2 horas:
   • Chambers
   • Tampas
   • Quadros (todos os 3 peças)
   • Parafusos
   • Juntas de borracha
   • Fórceps
   • Tesoura
   • Chaves Hex
2. Membranas limpo com Aquet sabão e água destilada.
3. Sonicate membranas em álcool 70% por 10 minutos.
4. Coloque as membranas limpa em plástico pratos quadrados. Se utilizando membranas padronizada, garantir que o lado padronizada é a face para cima (álcool de spray em um lado da membrana e prestar atenção para o líq....

Discussão

Banes et al. relatada pela primeira vez o uso de um sistema de estimulação mecânica das células in vitro, utilizando um substrato flexível elastomérica para entregar a força mecânica para as células ^1. Desde então, muitas variações sobre este projeto ter sido concebido e utilizado. Vários sistemas de estiramento mecânico estão disponíveis comercialmente sob o nome "Flexercell" (FlexCell International Corp), enquanto que alguns laboratórios usam custom-built dispositivos. Neste protocolo de vídeo que descrevemos a config.......

Materiais

Notas sobre a mídia: Estes experimentos estiramento uniaxial são propensos à contaminação devido à complexidade de configuração de biorreatores. Para combater isso, tentamos várias combinações de antibióticos e antifúngicos. O Fungizone 1% normalmente necessário, juntamente com uma combinação de antibióticos. Ou use uma combinação Pen / Strep, ou usar uma combinação de canamicina e gentamicina (mas não tente usar uma combinação / cocktail de três ou mais antibióticos em conjunto, como pode levar a bactérias resistentes a mutante, e também pode ser prejudicial para as células) .