Imagem bioluminescente da progressão do tumor de mama em um modelo de camundongo fêmea

Resumo

Fonte:
Marina Arantes Radicchi¹, Victor Carlos Mello¹,
Victória Paz Machado¹, Márcia Cristina Oliveira da Rocha¹, Jaqueline Vaz de Oliveira¹, Luana Cristina Camargo^1,2, Luís Alexandre Muehlmann¹, Ricardo Bentes Azevedo¹, Sônia Nair Bao¹, João Paulo Figueiró Longo<sup>1

1</sup>Instituto de Ciências Biológicas, Universidade de Brasília, ²Departamento de Processos Psicológicos Básicos, Instituto de Psicologia, Universidade de Brasília

Este vídeo demonstra o procedimento para rastrear a progressão do tumor in vivo, injetando células de adenocarcinoma de mama que expressam luciferase em um camundongo fêmea e monitorando sinais bioluminescentes para avaliar o crescimento do tumor primário e metastático ao longo do tempo

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Cultura de células

1. Manter a linhagem celular 4T1 (ATCC-CRL-2539), uma célula de adenocarcinoma de mama murina, em cultura com meio DMEM (meio de águia modificado de Dulbecco) suplementado com 10% de soro fetal bovino (v:v), penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100 U/mL), a 37 °C e em atmosfera umidificada contendo 5% de CO₂.
2. Transfectar a linhagem celular original com o gene Luc2, que expressa a luciferase. Esta enzima bioluminescente é produzida constitutivamente.

2. Modelo animal - Transplante de células tumorais

1. Inocular subcutaneamente células 4T1 bioluminescentes que expressam luciferase (2 × 10⁵ células por camundongo) no dorso esquerdo de camundongos fêmeas Balb / c sob anestesia (cetamina e xilazina a 80 mg / kg e 10 mg / kg, respectivamente).
   1. Para este procedimento, anestesiar o camundongo antes do experimento usando injeção intraperitoneal dos agentes anestésicos especificados (cetamina e xilazina a 80 e 10 mg / kg, respectivamente).
   2. Após 5 min de indução anestésica, raspe o camundongo e injete as células por via subcutânea usando seringas de insulina de 1 mL.
      NOTA: Um total de cinco camundongos de 8 semanas, pesando aproximadamente 25 g cada, foram utilizados para indução e imagem do tumor.
2. Para quantificar o crescimento do tumor in vivo, avalie o camundongo portador do tumor por imagens bioluminescentes, monitorando o crescimento do tumor por 4 semanas.
   1. Para experimentos de bioimagem, anestesiar o camundongo com isoflurano (2,5% diluído em ar comprimido purificado). Para avaliar a progressão do tumor, faça uma imagem do camundongo uma vez por semana durante 4 semanas usando equipamento que mede sinais bioluminescentes.
      NOTA: O sinal bioluminescente da luciferase 4T1-luc foi utilizado como parâmetro para avaliar o crescimento e indicar a progressão tumoral.
3. Durante o processo de imagem, posicione o mouse em uma posição dorsal reclinada dentro da área designada do equipamento para capturar as imagens bioluminescentes.
4. Após a anestesia, injete no camundongo D-luciferina (100 μL; 15 mg / mL) por via intraperitoneal.
   NOTA: Como a D-luciferina é um substrato para a enzima luciferase, que produz fótons de luz quando clivada, e as células de luciferase bioluminescentes 4T1 expressam essa enzima constitutivamente, quantificam e detectam o tumor em animais vivos.
5. Para detectar sinais, capture 20 imagens bioluminescentes em 20 minutos para cada animal em cada ponto final. Cada uma dessas imagens representa o sinal bioluminescente emitido durante um período de 60 s.
6. Construa uma curva cinética bioluminescente representando o sinal emitido a cada minuto. Para garantir os melhores resultados para cada animal, registar a emissão bioluminescente máxima para cada parâmetro.
7. Para captura de imagem de bioluminescência, use os seguintes parâmetros: filtro de emissão aberto, sem excitação, binning 8, f/stop 2 e campo de view tipo-D. Para gerar uma curva de crescimento, imagine os animais uma vez por semana durante um total de 4 semanas.
8. Imagem de bioluminescência - tumor primário e metástase pulmonar.
   1. Para distinguir entre o tumor primário e os sinais de metástase pulmonar, defina regiões específicas de interesse usando o software do equipamento.
   2. Identifique sinais bioluminescentes no local da injeção e na região torácica onde as células metastatizaram. Com base nessas imagens, calcule a progressão do sinal bioluminescente, que se correlaciona fortemente com a progressão do tumor.
   3. Com imagens coletadas ao longo de várias semanas, crie um perfil de cinética de crescimento para os diferentes locais do tumor, incluindo o tumor primário e as lesões metastáticas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
D-luciferina	Perkin Elmer	122799	Reagente químico
Dulbecos's modificado	Gibko	Rolamento A7030	Meios de cultura celular
Soro fetal bovino	Merck	F2442	Suplemento de Meios de Cultura Celular
Isoflurano	Cristália	NA	Anestésicos
IVIS Lumina	XR	Série III	Equipamento – EUA
Penicilina	Merck	Pág. 4333	Antibiótico de cultura celular
Faloidina-Alexa Fluor 488	Thermo Fischer	A12379	Reagente químico
Tampão fosfato salino	Merck	4437568	Reagente químico
Estreptomicina	Merck	Pág. 4333	Antibiótico de cultura celular