<ol style="margin-top: 0in"><li> Cortar pedaços da cauda (3mm) e as orelhas marca. </li><li> Adicionar 720 m l STE e 30 m l Proteinase K (10 ações mg / ml). </li><li> Incubar a 55 ° C em bloco de aquecimento e vortex a cada hora durante 3 horas a velocidade máxima por 10 segundos. </li><li> Inativar proteinase K a 70 ° C por 5 minutos. </li><li> Saciar em gelo durante 5 minutos. </li><li> Centrífuga DNA da cauda por 10 minutos na velocidade máxima. </li><li> Decantar em novo tubo contendo 720 m l Isopropanol. &nbsp; </li><li> DNA precipitar invertendo o tubo ou vórtex. </li><li> Spin down DNA por 5 minutos na velocidade máxima. Remover o sobrenadante. </li><li> Lavar pellet com etanol 70%. </li><li> Spin down DNA genômico 5 minutos à velocidade máxima. Remover o sobrenadante. </li><li> Permitir DNA para secar por 1-2 minutos. </li><li> Ressuspender DNA no 100-200 l m dependendo do tamanho do pellet. </li><li> Coloque o tubo a 55 ° C por 1 hora para facilitar a dissolução do DNA. &nbsp; </li></ol>

<table><tbody><tr><td>STE</td><td>Tampão</td><td></td><td></td><td>100 mm Tris; pH 8,5 /5 mM EDTA /0,2% SDS /200 mM NaCl / em H2O</td></tr><tr><td>TE</td><td>Tampão</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris; pH 5,0 /1 mM EDTA /10 mM NaCl</td></tr></tbody></table>

isolamento de dna genômico de tails rato

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Isolamento de DNA genômico de Tails rato

Este é um filhote de camundongo com 10 dias de idade e vou coletar uma biópsia da cauda para, em seguida, extrair o DNA genômico a partir dela. O que farei é cortar um pequeno pedaço da cauda, aproximadamente três milímetros, e então colocarei o fragmento da cauda em um tubo einor e o tubo einor sobre gelo seco. Agora, para evitar contaminação de um camundongo para outro, costumo marcar a lâmina de barbear na parte onde fiz o último corte.Dessa forma, para o próximo camundongo, terei o cuidado de usar uma lâmina de barbear limpa para coletar a próxima biópsia da cauda. Para distinguir entre os diferentes camundongos da sua ninhada, você precisará de um método para identificá-los. Uma maneira de fazer isso é perfurando um furo em suas orelhas usando um furador de orelha, como o mostrado aqui.Segure suavemente o camundongo pela nuca, vire-o e pinçe a cauda entre os dedos. Com a outra mão, segure o orifício da orelha, faça um corte rápido na orelha do camundongo nesse local. Perceba como foi indolor?Ok, agora você pode ver que tenho alguns pedaços de cauda nestes tubos de eppendorf e agora vou adicionar as soluções que irão ajudar na digestão. Primeiro, vou adicionar 720 microlitros de solução STE e, em seguida, vou adicionar 30 microlitros de proteína Ace K. Aqui está uma visão do pedaço de cauda que cortamos antes da digestão.Agora vou colocar os fragmentos da cauda em um bloco aquecedor a 55 graus. Muitos protocolos exigem agitação contínua a 55 graus, mas para os meus propósitos isso não será necessário, pois vou vortexar os fragmentos da cauda. Agora vou vortexar o fragmento da cauda por dois segundos.Um, dois. Após a vórtex, veja como está o interior do tubo eppendorf, onde é possível observar que o pedaço de cauda foi completamente dissolvido. Ative a proteinase K a 70 graus Celsius por cinco minutos. Interrompa a reação em gelo por cinco minutos.Centrifugue os peda&ccedil;os das caudas em uma microcentr&iacute;fuga por 10 minutos em velocidade m&aacute;xima. Nesta microcentr&iacute;fuga, a velocidade m&aacute;xima &eacute; de 13.000 RPM. Enquanto as caudas digestivas est&atilde;o sendo centrifugadas, rotule alguns tubos einor e preencha os tubos einor com 750 microlitros de isopropanol.Após centrifugar as caudas digeridas, os pelos e o material não digerido formarão um pellet no fundo do tubo decantado. A solução contendo o material digerido, STE e proteinase K será transferida para o tubo einor contendo o DNA em isopropanol, que começará a sair da solução, apresentando-se com aparência fantasmagórica e semelhante a penas, e bem ali, flutuando ao redor da bolha, está o DNA genômico isolado da cauda do camundongo. Após misturar a solução de isopropanol e STE, o DNA genômico sairá da solução e aparecerá como esta pequena esfera bem aqui; centrifugue o DNA genômico precipitado por cinco minutos em velocidade máxima em uma microcentrífuga.Aqui, na base do tubo, está o nosso DNA genômico em pellet. Agora vou aspirar a solução dentro do tubo, deixando apenas o pellet de DNA genômico para trás. Cada vez que aspirar outro tubo, trocarei a pipeta.Dica profissional: na ponta deste aspirador. Após aspirar o STE e o isopropanol, adicionarei um mililitro de etanol 70% para lavar o pellet de DNA genômico. Como o pellet de DNA genômico geralmente adere à parede do tubo de microcentrífuga e é difícil removê-lo para lavá-lo completamente no etanol 70%, será necessário arrastá-lo sobre o suporte para tubos de microcentrífuga que tenho aqui.Você pode fazer isso da seguinte maneira. Aqui está uma visão do DNA genômico após ter sido pelotizado e lavado em etanol a 70%. Vou centrifugar novamente por cinco minutos em velocidade máxima e, em seguida, aspirar o etanol a 70%, centrifugando novamente os pellets de DNA genômico após a lavagem.Adicione 70% de etanol, agite por cinco minutos em velocidade máxima, aspire o etanol a 70% e deixe o DNA secar por cinco minutos. Observe o pellet de DNA genômico no fundo do tubo, que deve estar aproximadamente tão seco quanto desejado. Assim, sequei os pellets de DNA genômico provenientes das caudas de camundongo e agora vou adicionar cem microlitros de triss 40 milimolar em pH oito.Então, tenho o DNA genômico a 50 graus Celsius, temperatura na qual ele se solubilizará mais rapidamente do que à temperatura ambiente. Após cerca de uma hora a 50 graus, vou congelá-lo ou armazená-lo a quatro graus até que eu deseje realizar minhas reações de PCR para determinar quais camundongos são positivos para meu transgene.

Isolamento de DNA genômico de Tails rato

Neste artigo

Protocolo

Materiais

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
STE	Tampão			100 mm Tris; pH 8,5 /5 mM EDTA /0,2% SDS /200 mM NaCl / em H2O
TE	Tampão			100 mM Tris; pH 5,0 /1 mM EDTA /10 mM NaCl