Demonstração de quantificação de dsDNA usando Molecular Probes PicoGreen corante e Hitachi Espectrofotômetro de Fluorescência F-7000 equipado com um acessório de leitor de microplacas.
Artigo de método
Quantificação de dsDNA usando a Hitachi F-7000 Espectrofotômetro de Fluorescência e PicoGreen Dye
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Resumo
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Resumo
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Quantificação de DNA, especialmente em pequenas concentrações, é uma tarefa importante, com uma ampla gama de aplicações biológicas, incluindo padrão ensaios de biologia molecular, tais como síntese e purificação do DNA, aplicações de diagnóstico, tais como a quantificação de produtos de amplificação de DNA, e detecção de moléculas de DNA em drogas preparações. Durante este vídeo vamos demonstrar a capacidade do espectrofotômetro Hitachi F-7000 de fluorescência equipado com um acessório Placa Micro Reader para realizar dsDNA quantificação usando Molecular Probes Quant-it PicoGreen kit reagente corante.
O Espectrofotômetro de Fluorescência F-7000 oferece alta sensibilidade e medições em alta velocidade. É um sistema altamente flexível, capaz de medir a fluorescência, luminescência, e fosforescência. Vários modos de medição estão disponíveis, incluindo comprimento de onda de digitalização, digitalizar tempo, fotometria e 3-D de medição de varredura. O espectrofotômetro tem sensibilidade na faixa de 50 picomoles de fluoresceína quando se utiliza um volume de amostra 300 mL na microplaca, e é capaz de medir velocidades de digitalização de 60.000 nm / minuto. Ele também tem uma ampla faixa dinâmica de até 5 ordens de magnitude, que permite o uso de curvas de calibração em uma ampla faixa de concentrações. O sistema óptico utiliza todos óptica reflexiva para o máximo de energia e sensibilidade. A faixa de comprimento de onda padrão é de 200 a 750 nm, e pode ser estendido a 900 nm quando se usa um dos opcionais perto fotomultiplicadores infravermelho. O sistema permite o controle de temperatura opcional para o leitor de placas 5-60 graus Celsius usando um externo opcional de temperatura controlada circulador de líquido. O leitor de microplaca permite o uso de 96 microplacas bem, ea velocidade de medição para 96 poços é menos de 60 segundos ao usar o modo cinética.
Controles de software para a F-7000 e Leitor de Microplacas também são altamente flexíveis. As amostras podem ser definidos em formatos uma coluna ou linha, e qualquer combinação de poços podem ser escolhidas para medições da amostra. Isto permite uma utilização óptima da microplaca. Além disso, o software permite importar as configurações da placa micro amostra criados no Excel e salvas em valores separados por vírgula, ou "csv" formato. Configurações microplaca de medição podem ser salvas e recuperadas pelo software para a conveniência e aumento da produtividade. Resultados dos dados pode ser saída para um relatório padrão, para o Excel, ou para um programa opcional Report Generator.
Protocolo
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1. Configuração do Instrumento
- Ligue o espectrofluorímetro e deixe aquecer por 1 hora.
- Usando o Excel cria um arquivo com as Normas e os dados da amostra, como mostrado na Figura 1 e salve-o em comma separated values "csv" formato.
Figura 1. Padrões e dados de amostras. - Configurar fluorímetro da seguinte forma:
- Clique na
botão, isto irá abrir a janela de Método de Análise, mostrado na Figura 2. 
Figura 2. Janela Método de Análise, na guia Geral.
Faça as seguintes seleções:- Na "medição" de campo, selecione Fotometria do menu suspenso.
- Em "Operador", digite o nome do operador apropriado.
- Não há necessidade de inserir informações no "Instrumento" campo. Esta é selecionado automaticamente pelo software.
- A "amostragem" de campo é inativa quando se utiliza o leitor de microplacas.
- Digite comentários que você pode querer incluir no relatório no campo "Comentários".
- No "acessório" de campo, insira as informações relacionadas com os acessórios utilizados para este teste.
- Nota os botões do lado direito da janela.
- O botão "Load" permite carregar Métodos de Análise salvo anteriormente.
- O botão "Salvar" permite a atualização de um conjunto de parâmetros de teste ou método de análise anteriormente salvo e carregado, usando o mesmo nome.
- O "Salvar como" botão permite salvar um novo conjunto de parâmetros de teste ou Método de Análise com um nome desejado.
Figura 3. Janela Método de Análise, guia quantitativa.- No "A determinação quantitativa do tipo" campo, selecione Wavelength. Isto indica a leitura de fluorescência será feita utilizando o comprimento de onda selecionado.
- Na "calibragem" tipo de campo, selecione 1 ª ordem.
- No "Número de comprimentos de onda" de campo, selecione 1.
- Na "Concentração unidade" de campo, entrar ng / mL.
- Deixe desmarcado as caixas para "Manual de Calibração" e "Força através da curva de zero".
- No "Digit após ponto decimal" campo, selecione 2.
- Na "Baixa-limite de concentração", digite 0.
- No campo limite "superior de concentração, digite 10000.
Agora clique em "Instrumento" guia e faça as seguintes seleções.
Figura 4. Janela de análise do método, guia Instrumento- No "modo de dados:" campo, selecione Fluorescência.
- O "Chopping velocidade" campo está inativo no momento, ele é usado somente para medições de fosforescência.
- No "modo de comprimento de onda" de campo, selecione Ambos fixo WL.
- Na "EX / WL1" field entrar 480nm.
- No "EM / WL1" field entrar 520nm.
- Todos os outros campos sob EX e EM estão inativos no momento.
- Na "EX fenda" campo selecione 5.0nm do menu suspenso.
- No "EM fenda" campo selecione 5.0nm do menu suspenso.
- Deixe desmarcada a caixa na frente da "Tensão PMT 1-1000V" campo.
- No "PMT Voltage" campo, selecione 700V do menu suspenso.
- No "Auto calc estatística. Número" campo selecione 2.
- No "Replica" campo selecione 1.
- No "tempo de integração" campo selecionar 0.1s.
- No "Delay" campo de digitar ou selecionar 0s.
Figura 5. Janela de análise do método, guia Monitor.- No "eixo Y", "Max:" campo, selecione 10000
- No "eixo Y", "Min:" campo, selecione 0.
- Selecione a caixa à esquerda do "Aberto de processamento de dados após a aquisição de dados".
- Deixe desmarcada a caixa à esquerda do "relatório de impressão depois de aquisição de dados", a menos que você queira um relatório a ser impresso automaticamente após as leituras sejam concluídas.
Figura 6. Janela de análise do método, guia do relatório.- Na "saída" de campo, selecionar Imprimir relatório do menu suspenso. Você também pode selecionar "Use Microsoft Excel" se você deseja que os dados exportados para o Excel, ou "Use Folha Generator Imprimir" se estiver usando o suplemento opcional no Gerador de Relatórios programa que permitirá gerar relatórios personalizados feitos.
- Clique nas caixas para os itens que você quer ser incluído no relatório.
- Para salvar todos os parâmetros selecionados nas diferentes guias do "Método de Análise" janela, clique novamente na guia "Geral" e salvá-las sob um nome de arquivo e em um local onde você pode encontrá-los para uso futuro, e clique no botão " OK "para fechar esta janela.
- Isso completa a criação de parâmetros de teste do instrumento.
- Agora vamos configurar o leitor de microplaca.
- Clique na
botão, que trará a janela de configuração do MPR em cima.
Figura 7. MPR janela de instalação, guia Plate.- Clique na posição A1 e arraste o mouse para E1, em seguida, clique na
botão. Isso irá selecionar as posições a serem utilizados para os padrões. Essas posições será destaque na cor verde. - Agora, precisamos selecionar as posições a F1 H3 para as amostras. Clique e arraste o mouse a partir de F1 posição, a posição H3 e depois clique no
botão, isto irá destacar as posições na cor amarela. - Em seguida, repita a mesma operação para os cargos de A2 E3, para selecionar as posições para medições da amostra.
- Agora, vamos carregar o arquivo Comma Separated arquivo (csv) Variável preparado com antecedência com as Normas e informação de amostra.
Figura 8. MPR janela de instalação, guia de informação bem.- Em seguida, clique na
botão. Uma janela do Windows Explorer será aberto que, como mostrado na Figura 9, o que permitirá localizar o "Bem information.csv" arquivo e carregá-lo. 
Figura 9. Carregando informações de amostra bem.
Depois de carregar o "Bem informações" arquivo, a "informação Bem" vai olhar como mostrado na Figura 10
Figura 10. Carregado de informações de amostra bem.
- Clique na
2. Picogreen Preparação de amostras de Ensaio
- Prepare 1X tampão TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA), adicionando 1 mL de 20 X tampão TEa 19 mL dI H 2 O.
- Prepare PicoGreen Solução Reagente pela adição de 50 mL 200 X Reagente PicoGreen para 9,95 1 X mL tampão TE.
- Elaborar normas (Lambda dsDNA) fazendo diluições em série de ações dsDNA (100 mcg / mL). Primeiro preparar uma solução de 50 mg / mL dsDNA adicionando 25 mL de estoque dsDNA (100 mcg / mL) e 25 mL 1 x tampão TE. Em seguida, preparar as soluções padrão, adicionando os volumes indicados de dsDNA e buffer como listadas na tabela abaixo:
Concentração de dsDNA Volume de dsDNA Volume de Tampão 1 mg / mL 20 mL de 50 mcg / mL dsDNA 980 mL 1 X tampão TE 0,1 g / mL 100 L de 1 mg / mL dsDNA 900 mL 1 X tampão TE 0,01 mcg / mL 100 L de 0,1 mcg / mL dsDNA 900 mL 1 X tampão TE 0,001 mg / mL 100 L de 0,01 mcg / mL dsDNA 900 mL 1 X tampão TE
3. Medição de Padrões e fluorescência da amostra
- Pipetar 150 mL de cada padrão em poços A1-E1 de uma placa de 96 poços, por Figura 7, e de acordo com a tabela a seguir:
Bem Padrão A1 1 mg / mL B1 0,1 g / mL C1 0,01 mcg / mL D1 0,001 mg / mL E1 1 X tampão TE - Pipetar 150 mL amostras desconhecidas em poços de F1 H3, mostrado na Figura 7
- Despeje PicoGreen solução preparada na etapa 1,2 em uma calha projetado para multi-canal de uso da pipeta. Use uma pipeta multi-canal para fornecer solução de 150 mL PicoGreen aos poços A1-H3. Solução de misturar e padrões cuidadosamente com pipeta.
- Colocar a placa na área escura e esperar 2-5 minutos para a reação para se desenvolver.
4. Resultados representante
A curva de calibração bom é avaliado utilizando os diferentes parâmetros fornecidos pelo software F-7000 em cima da medida das normas e cálculo da curva de calibração pelo software.
O coeficiente de determinação indica a qualidade do ajuste dos padrões de medida e calculada a curva de calibração. Quanto mais próximo este valor é "1", melhor o ajuste do valor medido e curva de calibração.
Se o valor está longe de "1", as normas devem ser reavaliados, preparado novamente, ou a adequação da curva de calibração mudou.
A Figura 11 mostra um exemplo de uma curva de calibração com um coeficiente de determinação calculado = 0,99993, obtidos para a quantificação de dsDNA usando PicoGreen corante.
Figura 11. Exemplo de dsDNA curva de calibração.
Discussão
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Pipetagem cuidadosa durante a preparação da amostra, bem como a utilização de um espectrofotômetro de fluorescência estável e sensível é essencial para obter bons resultados e reprodutíveis.
No caso do espectrofotômetro de fluorescência utilizado para este teste, sugere-se com 300 mL de amostra de volume final no leitor de microplacas. Menor volume diminui a sensibilidade, e um volume maior pode causar contaminação cruzada entre os poços.
Divulgações
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Luis A. Moreno e Kendra L. Cox são empregados por Hitachi High Technologies Latina que produz o instrumento utilizado neste artigo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários | |
|---|---|---|---|---|
| Reagente | H2O destilado | |||
| Kit de ensaio Quant-iT Picogreen dsDNA do | Reagente | P7589 | ||
| Microplacas de fluorescência Nalge Nunc p/n 237108 | Fornecimento | 237108 | ||
| 12 canais Eppendorf | Micropipeta 3516677 | |||
| 1000 μ L Eppendorf | Pipeta Supply | |||
| 200 μ L Eppendorf | Pipeta Fornecimento | |||
| 10 mL pipeta sorológica | Fornecimento | |||
| Folha de alumínio | Fornecimento | |||
| Pontas de pipeta | Fornecimento Hitachi | |||
| F-7000 Espectrofotômetro de fluorescência com FL Solutions 2.1 | Equipamento | 5J1-0003 | ||
| Leitor de microplacas Acessório para equipamento | 5J0-0139 |
Referências
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- Singer, V. L., Jones, L. J., Yue, S. T., Haugland, R. P. Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation. Analytical Biochemistry. 249 (2), 228-238 (1997).
Reimpressões e permissões
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