Entrega direta da MIF Morpholinos Into the Otocyst Zebrafish por injeção e Eletroporação afeta o desenvolvimento da orelha interna

Resumo

Um método para entregar morpholinos diretamente no otocyst zebrafish em 24hpf tem sido desenvolvido. Usando microinjeção de morpholinos no lúmen da vesícula ótica e eletroporação para efeito de penetração, fomos capazes de contornar o efeito de morpholinos sobre o cérebro e obter efeitos específicos para o ouvido interno.

Resumo

Nos últimos anos, eletroporação tornou-se uma técnica popular no transfecção in vivo de DNA, RNA e morpholinos em vários tecidos, incluindo o olho, cérebro e somitos do peixe-zebra. A vantagem de eletroporação sobre outros métodos de manipulação genética é que tecidos específicos podem ser direcionados, tanto espacialmente e temporalmente, para a introdução de macromoléculas pela aplicação de corrente elétrica. Aqui nós descrevemos o uso da eletroporação para transfecting mif e mif-like morpholinos para os tecidos do ouvido desenvolvimento interno do zebrafish. Em estudos anteriores, mif morfolino injetadas em embriões no 1 - de 8 células estágio resultou em ampla alterações morfológicas no sistema nervoso e olho, assim como o ouvido. Ao direcionar os tecidos do ouvido interno em fases posteriores de desenvolvimento, podemos determinar os efeitos primários da MIF no ouvido desenvolvimento interior, em oposição a efeitos secundários que podem resultar da influência de outros tecidos. Usando tubulina phalloidin e acetilada coloração para estudar a morfologia de neurônios, processos neuronais e células ciliadas da mácula associado a posterior, fomos capazes de avaliar a eficácia da eletroporação como um método de transfecção alvejado no ouvido zebrafish interior. As vesículas ótica de embriões foram injetados com 24hpf morpholinos e electroporated e foram comparados com embriões que haviam recebido nenhum tratamento ou tinham sido injetados ou apenas electroporated. Embriões que foram injetados e electroporated mostraram uma diminuição no número de células de cabelo, diminuição da inervação pelo gânglio statoacoustic (SAG) e menos neurônios SAG comparados com grupos controle. Nossos resultados mostraram que a entrega direta de morpholinos em otocysts em fases posteriores evita o sistema nervoso não-específica e efeitos da crista neural de morpholinos emitidos na fase celular 1-8. Ele também permite o exame dos efeitos que são direcionados para o ouvido interno e não efeitos secundários sobre a orelha de efeitos primários sobre o cérebro, ou mesênquima da crista neural periotic.

Protocolo

1. Eletrodos para fazer Eletroporação

1. Cortar 75 mM fio de tungstênio diâmetro (AM Systems, Inc. Carlsborg, WA) de comprimento adequado (cerca de 3-5 cm)
2. Coloque fio de tungstênio através de cabo conector molex (latão estampado pinos)
3. Enrole os fios de tungstênio e conector do cabo molex com tubulação do psiquiatra (SPC Technology, Chicago, IL) e aplicar calor com bico de Bunsen ou pistola de calor para selar o tubo de encolhimento para o fio
4. Para aguçar a ponta do fio de tungstênio, mergulhe o fio no hidróxido de sódio 1,0 N (Conrad et al. 1993) e, usando um clipe de papel como o outro eletrodo, electrolyze o fio com um Electroporator onda quadrada. As condições que usamos são 5 de 50 Volt pulsos cada uma com duração de 100 ms com 50 ms entre pulsos. Eletrodos deve ser aperfeiçoada para um diâmetro de 15-20 mM
5. Manter os fios em uma bandeja dentro de grooves pressionado em massa de modelar antes do uso em eletroporação

2. Set Up Station Eletroporação

1. Fita afiada 75μm eléctrodos de tungsténio para micromanipuladores (instrumentos de precisão Mundial).
2. Micromanipuladores lugar em ambos os lados do palco estereomicroscópio (Leica).
3. Ligar os eléctrodos a um cuy-21 Editar Protect Praça Electroporator Wave (Figura 1).
4. Ligue o electroporator e estabelecer parâmetros para eletroporação, incluindo tensão, duração de pulso, e número de pulsos. Os parâmetros mais eficazes para este experimento foram encontrados para ser de três pulsos de 13 volts que cada durou 5.0ms, com 100ms entre cada pulso. Se eletroporação cria bolhas de ar no embrião, reduzir a duração do pulso.

3. Microinjeção de Morpholinos Em vesícula ótica Zebrafish

1. Colheita de embriões zebrafish de um tanque de criação. Incubar os embriões em embrião de sensibilização média com 0,3 PPM de azul de metileno (Westerfield, 2005) com 28,5 ° C durante a noite.
2. Puxar agulhas de vidro com um puxador de Sutter P-97 eletrodo
3. Aquecer um gel de agarose base (1% agarose em água de peixe em um prato de 10 milímetros Petri) a 37 ° C em banho-maria
4. Heat 1% agarose de baixo ponto de fusão (IMPA) em peixes de água até derreter e mantê-lo aquecido em banho-maria a 37 ° C.
5. Preencher uma agulha de vidro com uma solução de morfolino (GeneTools, Corvallis, OR) e cortou a ponta de diâmetro adequado. Montar a agulha de injeção em um micromanipulador (Kuhn).
6. Cortar ponta da agulha para cerca de 10 mm e injetar o óleo mineral para garantir que a ponta permite a entrega suficiente de solução morfolino.
7. Dechorinate embriões em 24 postfertilization horas (hpf) e anestesiá-lo com MS222 (tricaina, Sigma) em 0,3 PPM peixes de água azul de metileno.
8. Alinhar 3-5 embriões anestesiados para a base de gel de agarose com o lado direito para cima para análise uniforme conveniente
9. Colocar 1-2 gotas de IMPA 1% sobre cada embrião e deixe solidificar para corrigir o embrião no lugar
10. Gire a placa de Petri, para que a vesícula ótica é no lado direito
11. Coloque a agulha dentro do lúmen da vesícula ótica e injetar a solução morfolino com um PV820 Pneumatic PicoPump (Instrumentos de Precisão World) com um tanque de nitrogênio em anexo (Figura 2)

4. Procedimento eletroporação

1. Mover os embriões montado para a estação de eletroporação imediatamente após a injeção
2. Coloque o eletrodo positivo sobre o tecido imediatamente posterior à vesícula ótica, mas não penetrar; inserir o eletrodo negativo para o cérebro imediatamente anterior à vesícula ótica
3. Aplicar atual usando um pedal ou empurrando um interruptor.
4. Despeje a água de peixe em agarose e remover embriões de agarose com roda e uma pipeta de vidro. Tenha cuidado para não danificar os embriões. Para os embriões que são difíceis de remover, use uma agulha suavemente para romper qualquer IMPA em torno do embrião.
5. Embriões lugar em um prato com água peixe azul de metileno e elevar os embriões para estágios desejado para análise (morfológico, imuno-histoquímica, em anlaysis situ hybridization etc, e microscópica).

5. Resultados representativos:

Figura 1. Estação de eletroporação. Eletrodos foram feitas usando fios de tungstênio afiadas 75μm e ligados por conduz a um cuy-21 Editar Protect Electroporator onda quadrada. Estes eletrodos foram gravadas para micromanipuladores.

Figura 2. Estação de injeção. Todos os embriões foram injetados na orelha direita para fins de normalização.

Figura 3. Coloração faloidina de filamentos de actina com 3 embriões dpf. (A) O embrião injecte 3 dpfd com controle de MO tem forte coloração de phalloidin na mácula posterior (pm). (B) O embrião que foi injetado com controle de MO e depois electroporated tinham níveis semelhantes de coloração em phalloidin pm nos embriões de injeção única. (C) Injeção com mif MOs na vesícula ótica sozinho não causou redução da coloração phalloidin, enquanto a injeção de mif MOs juntamente com eletroporação causou uma redução drástica de coloração phalloidin na pm (D). am mácula, anterior.

Figura 4. Faloidina coloração dos filamentos de actina com 5 larvas dpf. Não houve diferença entre a injeção apenas (A) e injeção com eletroporação quando o padrão de controle de morfolino foi usado (B). No entanto, as larvas dpf 5 que foram injetados com mif morpholinos e electroporated mostraram redução da coloração phalloidin na mácula posterior (pm) (D), embora menos dramático do que três dpf, quando comparado com o embrião que foi injetado com mif morpholinos apenas (C ). am mácula, anterior.

Figura 5. Coloração tubulina acetilados de embriões em 3 dpf. O embrião em (A) não recebeu qualquer injeção ou eletroporação. O embrião em (B) foi electroporated mas não recebeu a injeção. Embriões de receber a injeção e eletroporação (C, D) com mif morpholinos tinha visivelmente coloração tubulina diminuiu em comparação aos controles. (Macula pm, posterior).

Figura 6. Coloração tubulina acetilados de embriões em 3 dpf com controle de morfolino. (A) Embrião sem nenhum tratamento mostrou forte coloração tubulina acetilada na mácula posterior (pm) e inervação extensiva. (B) Embrião injetados com controle de morfolino. (C) de embriões tratados com apenas eletroporação. (D) do embrião de controle com controle de morfolino injetado e electroporated tem níveis semelhantes de tubulina acetilada na mácula e inervação posterior comparação com o controle do tratamento não.

Discussão

Introduzimos com sucesso MOs oligonucleotídeo antisense no ouvido do embrião zebrafish 24 hpf. Embriões que foram levantadas após a injeção e eletroporação eram viáveis. Se os embriões sobreviveram à eletroporação, que cresceu a taxas normais em comparação com embriões que haviam recebido nenhum tratamento, bem como embriões que só tinha sido injetados e os embriões que só tinha sido electroporated.

Observamos os efeitos da mif e mif-like MOs após a injeção de ouvido e eletroporação através da rotulagem com phalloidin e tubulina acetilados. Faloidina coloração dos filamentos de actina em células sensoriais ciliadas da mácula posterior indica que eletroporação de mif e mif-like MO na fase 24 hpf causou mudanças na célula de cabelo e / ou números de estereocílios, quando comparado aos embriões que foram apenas injetado com o MOs (Figura 3). Esta diminuição no número de células ciliadas é consistente com os achados de Shen et al. (Submetido) que MOs para mif e mif-como causar uma redução no número de células ciliadas da mácula sacular. A diminuição do número de células de cabelo em embriões que foram injetados com MOs e electroporated demonstrar que eletroporação pode ajudar em mover o MOs através da membrana celular, aumentando assim a extensão dos efeitos morfológicas quando comparadas com embriões no qual a vesícula ótica só foi injetado. Alterações na morfologia do gânglio statoacoustic foram observados através de coloração tubulina acetilados. A extensão da inervação pelo gânglio statoacoustic foi afetada, como embriões que foram injetados e electroporated mostram diminuição da ramificação das neurites (Figura 5). Também pode haver diminuição da condensação das células ganglionares e / ou diminuição do número de células ganglionares, porque a coloração tubulina acetilada é significativamente diminuída em embriões que eram injetadas e electroporated. Mif porque tem se mostrado fundamental para o desenvolvimento do sistema nervoso (Suzuki et al., 2004), as mudanças observadas após a eletroporação pode ser o resultado de transfecção aumento da mif e mif-MO como solução para as células neuroblastos.

Eletroporação de oligo antisense morpholinos diretamente em um tecido em desenvolvimento é uma ferramenta útil para controlar a expressão de um gene durante o desenvolvimento que o tecido, tanto espacialmente e temporalmente, no embrião. Eletroporação de mif e mif-like MOs para os tecidos do ouvido interno resultou em alterações morfológicas de ambos macula o posterior eo gânglio statoacoustic. Houve uma redução no número de células sensoriais ciliadas na mácula posterior nos embriões que haviam sido injetados e electroporated em comparação com embriões que haviam recebido nenhum tratamento ou com embriões que tinham sido apenas injetados ou apenas electroporated. Houve também uma diminuição no grau de inervação do patch posterior sensoriais pelo gânglio statoacoustic eo tamanho do SAG. Eletroporação é um método valioso para transfecting macromoléculas em tecidos específicos, com a vantagem de observar os efeitos primários do que o DNA particular, RNA, ou MO no tecido desejado e discriminar estes de efeitos secundários sobre outros tecidos, incluindo o cérebro, da crista neural e mesênquima periotic sobre o desenvolvimento do ouvido interno (Barald e Kelley, 2004).

Materiais

1. MOs: 0,3 mM de uma combinação de para mif, mif-like MO1 e mif-like MO2 foi usado.
   Mif MO é gratuito para o códon de iniciação do mRNA zebrafish mif: 5'-acatcggcatgactgcgacagagat-3 '. Dois MOs foram usados ​​para mif-like mif-like MO1 é gratuito para o local de início de translação:. 5'-GTTTCTATATTTATGAACGGCATGA-3 ', enquanto mif-like MO2 derivado AS seqüência na fronteira intron1/exon 2: 5'-GATTCATCCTCTGAAGACGTAAGCC -3 '. Controle de MO foi a seqüência de nucleotídeos a partir de Ferramentas mexidos Gene: 5'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA-3 '.
2. azul de metileno (0,3 ppm) em água de peixes
3. MS222 (tricaina, Sigma, 0,64 mM em água de peixe)
4. Baixo ponto de fusão de agarose (IMPA; Roche)
5. vermelho de fenol (Sigma)
6. Anti-acetilado tubulina (Sigma)
7. Alexa Fluor ® 488 cabras de anticorpos anti-rato segundo (sondas Molecular)
8. Texas vermelho-phalloidin (sondas Molecular)