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1. Insetos
- Umbigo orangeworm, Amyelois transitella (Walker) (Lepidoptera: Pyralidae) colônia em nosso laboratório originado de mariposas coletadas de amendoeiras em Fresno, CA. Nossa colônia de insetos são mantidos em câmaras climáticas (Percival Inc, IA) a 28 ± 2 ° C, 75 ± 10% de umidade relativa, e sob 16:08 h (luz: escuro) foto regime.
- Mariposas emergentes são coletados diariamente, sexados e transferidos para caixas de plástico (669 mL lancheira, 13 x 13 cm, altura, 4,5 cm, Rubbermaid) fornecido com até 10 camadas de toalhas de papel embebido de água (Thirsty Ultra Absorvente, 27,9 x 27,9 cm ; Safeway). Tampas de caixas são perfuradas para permitir a circulação de ar. Esse arranjo fornece ~ 100% RH.
- Para medições eletrofisiológicas usamos 2-4 dias após a emergência das mariposas de idade, que são mantidos sob alta umidade.
2. Preparação eletrofisiológicas
- Mariposas (machos ou fêmeas) são gentilmente empurrado para uma ponteira (200 mL, EUA Scientific Inc) que é cortado de cima para ter um diâmetro da ponta de grande porte (ca. 2 mm). A mariposa é delicadamente empurrado através da outra extremidade com uma ponta de lenço de papel umedecido, até as antenas e parte da cabeça se projetam a partir da ponta.
- Cabeça exposta é imobilizado, cobrindo a cabeça com uma argila não-secagem (Claytoon, Van Aken International, CA), deixando uma pequena parte de um olho e duas antenas expostas. Esta preparação é colocado sobre uma plataforma do micromanipulador EAG MP-12 (Syntech, Alemanha) entre os dois titulares do eletrodo.
- Usamos eletrodo de vidro feita a partir de 1,0 milímetros tubos capilares de borosilicato com filamento (WPI Inc, FL) e puxou em um modelo P-97 micropipeta extrator (Sutter Instruments, CA) para obter microeletrodos de menos de uma ponta micrômetro. Eletrodos estão de volta cheio de sensillum linfáticos campainha (Kaissling e Thorson 1980). Um eletrodo empala a área exposta do olho sob o microscópio (Leica MZ75) e serve como referência, enquanto o eletrodo de registro acomoda as duas antenas. Para facilitar o contato, distal 1-2 segmentos antenais são cortadas antes de ser inserido no eletrodo de registro. Para gravações de sinais de sensilla individuais, modificar um pouco essa configuração em que o eletrodo de registro é empalado sob o microscópio (Olympus BX51WI; 800x de ampliação). Potenciais de ação são registrados, inserindo o eletrodo de vidro na base de um sensillum. Sinais são amplificados por uma alta impedância pré-amplificador (Syntech, Alemanha) e alimentado em um UB-IDAC a serem analisados off-line com AUTOSPIKE software (Syntech, Alemanha). AC sinais passa-banda são filtradas entre 100 Hz -10.000 e potenciais de ação são extraídos por computador usando um algoritmo AUTOSPIKE que distingue o seu pico-cocho para-amplitudes do ruído. Respostas dos neurônios individuais são calculadas como o aumento (ou diminuição) na freqüência de potencial de ação (picos por segundo) sobre a freqüência espontânea.
3. Os estímulos químicos e protocolo de estimulação
- Produtos químicos de alta pureza são usados. Um importante componente do feromônio da fêmea orangeworm umbigo, (Z, Z) -11,13-hexadecadienal foi obtida a partir Bedoukian Research Inc, CT. Produtos químicos são diluídos, w / v, com vidro-hexano destilada para fazer soluções estoque de 10 diluições mcg / mL e decádico são feitas. Uma alíquota (10 mL) de um estímulo químico dissolvido em hexano é carregado em um filtro de papel Whatman strip (8x40 mm), o solvente é evaporado agitando por 10 s sob uma coifa ea faixa é colocada em um polipropileno 5 mL seringa (seringas BD, NJ) a partir do qual vários volumes são ejetados. Hexano sozinho e uma seringa vazia servir como controle.
- A preparação é realizada em uma corrente de ar umidificado entregues pelo controlador de estímulo Syntech (CS-55 modelo; Syntech, Alemanha) a 20 mL / sec para o qual um pulso de estímulo de 4 mL / s é adicionado para 500 ms. Sinais são captados por 10 s, 2 s de partida antes do início do pulso de estímulo. Preparação antenais é estimulado com 500 ms de pulso durante o qual ca. 2 mL do ar purificado a partir de uma seringa de 5 mL de polipropileno contendo o estímulo é adicionado para o fluxo de ar principal. Um intervalo de pelo menos 1 min ou mais, seguindo alta respostas, é permitido entre as estimulações.
4. Resultados representante
Antenas das mariposas restringido (Figura 1) estimuladas com componente feromônio feminino, (Z, Z) -11,13-hexadecadienal gerar respostas a dose robusta dependente (Figura 2). Este componente principais feromônio também provoca dose-dependente respostas excitatórias de longo trichodea sensilla (Figura 3A), como exibido em vestígios de gravações única unidade (Figura 3B).
A Figura 1. Viva umbigo orangeworm traça contido e antena exposta
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Figura 2. Dose respostas dependentes EAG atingida em resposta a (Z, Z) -11,13-hexadecadienal, um componente importante feromônio feminino.
Figura 3. Sensilla trichoid no sexo masculino umbigo orangeworm traça responder a (Z, Z) -11,13-hexadecadienal de uma forma dose-dependente. (A) da antena do macho umbigo orangeworm mariposa é multi-segmentada e cada segmento é adornado com um grande número de cabelo como estruturas, sensilla. A micrografia eletrônica de varredura, mostrando detalhes na inserção (barras de escala são 200 e 50 mM, respectivamente). (B) Extracelular única unidade de gravações de um sensillum trichoid.