Levedura Método Embedding Colony

Resumo

Um método para a incorporação de colônias de leveduras permitindo o corte de microscopia óptica e eletrônica. Este protocolo permite a determinação da distribuição de células esporuladas e células pseudohyphal dentro colônias fornecendo uma nova ferramenta para a compreensão da organização de tipos de células dentro de uma comunidade de fungos.

Resumo

Padronização dos diferentes tipos de células de embriões é um mecanismo fundamental no desenvolvimento metazoários. Comunidades de microrganismos, tais como colônias e biofilmes também exibem padrões de tipos de células. Por exemplo, na levedura S. cerevisiae, células e células esporuladas pseudohyphal não são uniformemente distribuídos em colônias. A importância funcional da padronização e os mecanismos moleculares que fundamentam esses padrões ainda são pouco compreendidos.

Um desafio que diz respeito à investigação de padrões de tipos de células em colônias de fungos é que, diferentemente do tecido metazoários, as células em colônias são relativamente fracamente ligados um ao outro. Em particular, colônias de fungos não contêm o mesmo nível extensivo de matriz extracelular encontrado na maioria dos tecidos. Aqui nós relatamos em um método para a incorporação e secção colônias de leveduras que revela o interior padrões de tipos de células nessas colônias. O método pode ser usado para preparar seções espessas (0,5 μ) úteis para microscopia de luz e cortes finos (0,1 μ) adequado para microscopia eletrônica de transmissão. Células ascos e pseudohyphal podem ser facilmente distinguidas das células de levedura ovóide por microscopia de luz, enquanto a estrutura interior destas células pode ser visualizado por EM.

O método baseia-se em torno colônias com agar, infiltrando-los com o meio Spurr, e depois do corte. Colônias com um diâmetro na faixa de 1-2 mm são adequados para este protocolo. Além de visualizar o interior das colônias, o método permite a visualização da região da colônia, que invade o agar subjacente.

Protocolo

1. Isolamento colônia e Fixação

1. Incubar 300 colônias em ágar durante o tempo indicado (uma colônia isolada deve ser 1-2 mm de diâmetro).
2. Remover colônia (viradas para cima) e médio subjacente usando uma espátula estreita.
3. Coloque algumas gotas de agar 2% 42 ° C em uma lâmina de microscópio utilizando 1 mL Pipetman ponta e imediatamente colônia lugar no rosto de agar-se antes que ela se solidifica.
4. Coloque algumas gotas de agar 2% 42 ° C na colônia e deixar solidificar.
5. Use luvas para todas as etapas até o final deste protocolo
6. Bloco guarnição com lâmina de barbear e colocá-los em um frasco de borosilicato 3....

Discussão

O método apresentado revela as estruturas interior das colônias. Porque o método é eficaz na determinação dos padrões de tipos de células em um intervalo de S. cepas cerevisiae com morfologias diferentes colônia, e também em uma espécie aparentada S. paradoxus ^5, o método também é passível de trabalhar em uma grande variedade de fungos e outros microorganismos.

Um passo crítico para o sucesso do método é garantir que toda a colônia, incluindo a parte superior da .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tetraóxido de ósmio	Electron Microscopy Sciences	RT 19152
Modelos de inclusão de silicone	Fisher Scientific	NC 9975029
Resina epóxi cicloalifática	Electron Microscopy Sciences	RT 15004	ERL 4221
Resina epóxi	Electron Microscopy Sciences	RT 13000	DER 736
Anidrido nonenil succínico	Electron Microscopy Sciences	RT 19050	NSA
2-Dimetil amino–etanol	Electron Microscopy Sciences	RT 13300	DMAE
Meios de montagem	KPL Inc	71-00-16
Roda rotativa	Ted Pella, Inc.	Pelco 1055
Microtomo	Leica Microsystems	Ultracut S