Rato injeção parede da bexiga é uma abordagem útil para estudo de células da bexiga ortotopicamente-tronco e biologia do câncer. Este método de microcirurgia delicada pode ser dominada com técnica cuidadosa e prática.
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Artigo de método
Injeção do mouse parede da bexiga
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Resumo
Resumo
Rato injeção parede da bexiga é uma técnica útil para estudar fenômenos ortotopicamente bexiga, incluindo células-tronco, o músculo liso, e biologia do câncer. Antes de iniciar as injeções, a área cirúrgica deve ser limpa com água e sabão e solução anti-séptica. Equipamentos cirúrgicos devem ser esterilizadas antes do uso e entre cada animal. Cada rato é colocado sob anestesia isoflurano inalado (2-5% para a indução, 1-3% para manutenção) e sua bexiga exposta, fazendo uma incisão mediana abdominal com uma tesoura. Se a bexiga está cheia, é parcialmente descompactado pelo gentil espremendo entre dois dedos. A suspensão de células de interesse é intramurally injetado na parede da cúpula da bexiga usando uma agulha de calibre 29 ou 30 e 1 cc ou menor seringa. A ferida é então fechada com grampos de sutura eo mouse permitiu recuperar em uma almofada de aquecimento. Injeção de parede da bexiga é uma técnica de microcirurgia delicada que pode ser dominada com a prática.
Protocolo
1. Injeção do mouse parede da bexiga
Escolha da tensão do mouse, idade e sexo é ditada por necessidades experimental. Nós usamos ratos entre 8 e 12 semanas de idade, uma vez que esta é uma janela de maturidade imunológica antes de senescência. Como orientação geral, os ratos devem chegar pelo menos uma semana antes da manipulação experimental, a fim de evitar o stress induzido por fatores de confusão.
- Limpe a superfície da mesa cirúrgica com água e sabão.
- Limpe a superfície da mesa cirúrgica com Swipes Cide ou toalhetes anti-séptico.
- Autoclave instrumentos cirúrgicos limpos antes da sua utilização na cirurgia.
- Além disso, esterilizar instrumentos cirúrgicos com esterilizador talão quente imediatamente antes do uso, bem como entre os animais durante a cirurgia.
- 100 seringas limpas mL Hamilton e 29 ou 30 gauge (1 / 2 polegada de comprimento) agulhas por aspiração repetida e injeção com álcool absoluto antes da primeira utilização e, ao final do procedimento cirúrgico definitivo.
- Lave e enxágüe com seringas esterilizadas Hamilton tampão fosfato entre cada animal.
- Anestesiar ratos, colocando-os em uma câmara de indução isoflurano, com o conjunto de isoflurano entre 2-5%.
- Uma vez que a anestesia geral é alcançado, retire o rato da câmara e coloque na posição supina com uma almofada debaixo quente para ajudar a manter a temperatura corporal normal.
- Obter anestesia de manutenção, colocando o focinho do animal em um bocal contendo vaporizar isoflurano (titulado de 1-3%, conforme necessário para manter a anestesia apropriado).
- Raspar a pele abdominal com clippers.
- Use um descartáveis, cortina cirúrgica estéril para cobrir o ânus para evitar a contaminação fecal durante a cirurgia.
- Use um segundo descartáveis, cortina cirúrgica estéril para cobrir o campo cirúrgico (abdome inferior).
- Prep abdômen com três pedaços de Betadine-gaze. Repita este passo três vezes.
- Usando um microscópio de dissecação para ampliação, faça uma menor incisão mediana abdominal com uma tesoura.
- Expor a bexiga.
- Se a bexiga está cheia, descompactá-lo parcialmente por uma pressão descendente suave na cúpula.
- Injetar a solução de amostra (até 50 mL), usando uma agulha de calibre 29 ou 30 e seringa, na parede da cúpula da bexiga (injeção intramural), com o bisel da agulha voltado para cima.
- Empurre o êmbolo da seringa para injetar a solução de amostra na parede da bexiga. A bolha bem localizada é uma indicação do sucesso de injeção das células na parede da bexiga.
- Retire a seringa, fechar a incisão com grampos de sutura e permitir que o mouse para se recuperar em uma almofada de aquecimento.
2. Resultados representativos:
A bolha bem localizada que não líquido de vazamento e permanece estável em tamanho é uma indicação do sucesso de injeção das células na parede da bexiga (Figura 1). Análise histológica pode ser realizada para confirmar a presença das células injetadas na parede da bexiga.
Figura 1. Exemplo de injeção de sucesso da parede da bexiga usando tinta nanquim para ilustração.
Figura 2. Esquemática de procedimentos experimentais.
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Discussão
Rato injeção parede da bexiga permite a implantação de células específicas em áreas definidas da parede da bexiga. Esta técnica tem amplas aplicações para os modelos do rato do cancro da bexiga, o músculo liso, e biologia das células estaminais. Por definição, mouse injeção de parede da bexiga facilita a introdução de câncer de bexiga ou de células-tronco em um local ortotópico assim que o seu crescimento e diferenciação pode ser estudado em um contexto fisiologicamente relevantes anatômicas. Na verdade, Dinney et al. d...
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Agradecemos o apoio de uma bolsa-piloto do Fundo de Investigação Stanford Pediátrica e K08DK087895-01 do NIDDK.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | |
| Isoflurano (Aerrane) | Baxter | NDC 10019-773-60 | |
| 29 ou 30 agulhas | Hamilton | 7803-06 ou 7803-07 | |
| 100 seringa microlitro | Hamilton | 7656-01 |
Referências
- Dinney, C. P., Fishbeck, R., Singh, R. K., Eve, B., Pathak, S., Brown, N., Xie, B., Fan, D., Bucana, C., Fidler, I. J., Killion, J. J. Isolation and Characterization of Metastatic Variants from Human Transitional Cell Carcinoma Passaged by Orthotopic Implantation in Athymic Nude Mice. The Journal of Urology. 154, 1532-1538 (1995).
- Singh, A. V., Franke, A. A., Blackburn, G. L., Zhou, J. Soy Phytochemicals Prevent Orthotopic Growth and Metastasis of Bladder Cancer in Mice by Alterations of Cancer Cell Proliferation and Apoptosis and Tumor Angiogenesis. Cancer Res. 66, 1851-1858 (2006).
- Yanagiuchi, A., Miyake, H., Nomi, M., Takenaka, A., Fujisawa, M. Modulation of the Microenvironment by Growth Factors Regulates the In Vivo Growth of Skeletal Myoblasts. BJU International. 103, 1569-1573 (2009).
- Miyake, H., Hara, I., Yamanaka, K., Gohji, K., Arakawa, S., Kamidono, S. Overexpression of Bcl-2 Enhances Metastatic Potential of Human Bladder Cancer Cells. British Journal of Cancer. 79, 1651-1656 (1999).
- Chancellor, M. B., Yokoyama, T., Tirney, S., Mattes, C. E., Ozawa, H., Yoshimura, N., Groat, W. C. de, Huard, J. Preliminary Results of Myoblast Injection into the Urethra and Bladder Wall: a Possible method for the Treatment of Stress Urinary Incontinence and Impaired Detrusor Contractility. Neurourol Urodyn. 19, 279-287 (2000).
- Dinney, C. P., Tanguay, S., Bucana, C. D., Eve, B. Y., Fidler, I. J. Intravesical Liposomal Muramyl Tripeptide Phosphatidylethanolamine Treatment of Human Bladder Carcinoma Growing in Nude Mice. J Interferon Cytokine Res. 15, 585-592 (1995).
- Mohamedali, K. A., Kedary, D., Sweeney, P., Kamaty, A., Davisy, D. W., Evey, B. Y., Huangy, S., Thorpez, P. E., Dinney, C. P., Rosenblum, M. G. The Vascular-targeting Fusion toxin VEGF121/rGel Inhibits the Growth of Orthotopic Human Bladder Carcinoma Tumors. Neoplasia. 7, 912-920 (2005).
- Slaton, J. W., Perrotte, P., Inoue, K., Dinney, C. P., Fidler, I. J. Interferon-α-mediated Down-Regulation of Angiogenesis-related Genes and Therapy of Bladder Cancer Are Dependent on Optimization of Biological Dose and Schedule. Clinical Cancer Research. 5, 2726-2734 (1999).
- Yokoyama, T., Huard, J., Pruchnic, R., Yoshimura, N., Qu, Z., Cao, B., De Groat, W. C., Kumon, H., Chancellor, M. B. Muscle-Derived Cell Transplantation and Differentiation into Lower Urinary Tract Smooth Muscle. Urology. 57, 826-831 (2001).
- Chan, E., Patel, A., Heston, W., Larchian, W. Mouse Orthotopic Models for Bladder Cancer Research. BJU International. 104, 1286-1291 (1988).
- Russell, P. J., Jelbart, M., Wills, E., Singh, S., Wass, J., Witherspoon, J., Raghavan, D. Establishment and characterization of a new human bladder cancer cell line showing features of squamous and glandular differentiation. Int. J. Cancer. 41, 74-74 (1988).
- Ahlering, T. E., Dubeau, L., Jones, P. A. A new in vivo model to study invasion and metastasis of human bladder carcinoma. Cancer Res. 41, 6660-6660 (1987).
- Heaney, J. A., Omellas, E. P., Daly, J. J., Lin, J. C., Rout, G. R. In vivo growth of human bladder cancer cell lines. Invest. Urol. 15, 380-380 (1978).
- Hadaschik, B., Black, P., Sea, J., Metwalli, A., Fazli, L., Dinney, C., Gleave, M., So, A. A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumor inoculation and bioluminescence imaging. BJU International. 100, 1377-1384 (2007).
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Reimpressões e permissões
