L'administration passive d'anticorps monoclonaux contre H. capsulatum Et autres pathogènes fongiques

Summary

Souris C57BL / 6 ont été utilisés pour étudier la pathogenèse Hc et de fournir le meilleur modèle. Nous explorons les avantages potentiels de l'immunité humorale contre ce champignon et a généré plusieurs anticorps monoclonaux [à histone H2B et une protéine de choc thermique 60kDa] que nous avons testés pour leur efficacité protectrice après l'administration par voie intrapéritonéale.

Abstract

Le but de l'utilisation de cette méthodologie est 1) pour faire progresser notre capacité de protéger les individus avec un anticorps ou un vaccin pour prévenir ou traiter l'histoplasmose causée par le champignon Histoplasma capsulatum et 2) d'examiner le rôle des facteurs de virulence comme cible pour la thérapie. Pour générer des AcM, les souris sont immunisées, les réponses immunitaires sont évalués en utilisant une phase solide système ELISA développée dans notre laboratoire, et la meilleure souris répondeur sont sélectionnés pour l'isolement de splénocytes pour la fusion avec des cellules d'hybridome. Souris C57BL / 6 ont été largement utilisées pour étudier H. pathogenèse capsulatum et de fournir le meilleur modèle pour obtenir les données requises. Afin d'évaluer le rôle des anticorps monoclonaux dans l'infection des souris par voie intrapéritonéale sont administrés avec soit mAb à H. capsulatum ou isotype témoin apparié mAb puis infectées soit par voie intraveineuse (iv), intrapéritonéale (ip) ou intranasale (in) itinéraires. Dans la littérature scientifique, l'efficacité des anticorps monoclonaux pour des infections fongiques chez la souris repose sur la mortalité comme un point final, en collaboration avec les unités formin colonie (UFC) des évaluations à des moments plus tôt. Survie (le temps de la mort) des études sont nécessaires car ils représentent le mieux la maladie humaine. Ainsi, l'efficacité de notre intervention ne serait pas suffisamment établie sans courbes de survie. Cela est également vrai pour établir l'efficacité du vaccin ou des tests de mutants de virulence. Avec l'histoplasmose, les souris vont souvent d'être énergique pour morte pendant plusieurs heures. La capacité d'une intervention telle que l'administration d'un anticorps monoclonal peut d'abord protéger un animal de la maladie, mais la maladie peut rechutes qui ne serait pas réalisé dans les expériences de courte UFC. En plus de la survie et des dosages charge fongique, nous examinons les réponses inflammatoires à l'infection (histologie, le recrutement cellulaire, les cytokines). Pour la survie / heure aux expériences de mort, les souris sont infectées et surveillées au moins deux fois par jour pour des signes de morbidité. Afin d'évaluer la charge fongique, l'histopathologie, et les réponses des cytokines, les souris sont euthanasiées à divers moments après l'infection. Les expérimentations animales sont réalisées selon les directives de l'Institut d'études des animaux de l'Albert Einstein College of Medicine.

Protocol

1. La croissance de H. Capsulatum

1. Préparer une enceinte de sécurité biologique pour le travail avec le champignon par le nettoyage de l'armoire avec l'eau de Javel à 10% puis 20 min d'irradiation UV. H. capsulatum dans la phase de la levure nécessite du niveau de biosécurité (BSL) pratiques II, tandis que la forme du moule nécessite BSLIII. Utilisez la forme levure dans les étapes suivantes.
2. Suivant préparer un tube de 15 ml conique avec 5 ml de PBS. Récolte d'une colonie de H. capsulatum (Hc souche ATCC G217B) à partir d'une plaque de BHI agar au sang [de glucose à 10 g / L, la cystéine 0,1 g / L, la pénicilline-streptomycine 1% et les moutons des globules rouges à 50 ml / L (Colorado Serum Co., Colorado, USA) ] cultivées à 37 ° C ou prélever une aliquote de stock levures congelés à -80 ° C et l'ajouter à la PBS. Vortex les cellules vigoureusement et centrifugeuse pour 1100 xg pendant 10 min à température ambiante. Retirer délicatement le surnageant sans perturber le culot et ajouter 10 ml d'PBS frais. Répétez cette procédure trois fois. Suspendre les cellules dans 5 ml de PBS et de transférer à un tube conique de 50 ml.
3. Pour perturber les cellules agrégées, passer la suspension de cellules de levure dans un G1 26 / 2 u aiguille chanter une seringue de 10 ml 5 fois dans une enceinte de sécurité biologique (utilisant la protection du visage). Pour isoler les petits, la levure uniforme de taille, centrifuger les cellules à 55 g pendant 1 min à température ambiante, puis enlever le haut de 1 ml.
4. Ajouter la suspension cellulaire dans un erlenmeyer stérile contenant 100 ml de milieu HAM F12 (Gibco) supplémenté avec 16 g / L de glucose, 1g / L d'acide glutamique, 8.4mg / L cystine, 6g / l d'acide glutamique et ensuite pousser les cellules à 37 ° C pendant 48 h dans un incubateur à 150rpm secouant.

2. Croissance hybridome et purification d'anticorps monoclonaux

1. Transfert des hybridomes sélectionnés pour un milieu DMEM contenant 10% de sérum de veau foetal, NCTC 10%, 1% de non-acides aminés essentiels et 1% de pénicilline-streptomycine. Cultiver les cellules dans un flacon de culture cellulaire (Becton Dickinson) pendant 5-7 jours à 37 ° C CO / 5% _2.
2. Puis centrifuger le milieu à 1100 xg pendant 10 min à température ambiante et de recueillir toutes le surnageant sans perturber les pastilles.
3. Ensuite, purifie le surnageant cellulaire gratuitement en utilisant une protéine Une résine / G par FPLC.
4. La concentration du MAB peut alors être calculée par une capture (1) ELISA utilisant un contrôle isotype IgG en standard (figure 1B).

3. Préparation Histoplasma capsulatum inoculum

1. Prenez un 48 h Histoplasma capsulatum (Hc souche ATCC G217B) culture en phase de levures cultivées en HAM F-12 à moyen terme.
2. Centrifuger les cellules à 1100 xg pendant 10 min. Jeter le surnageant et ajouter du PBS frais.
3. Répétez la procédure 3.2 à 3 reprises.
4. Passez à la suspension de cellules de levure 5 fois par une aiguille 26G1 / 2 à l'aide d'une seringue.
5. Centrifuger la suspension à 55 g pendant 1 min à grappes culot cellulaire résiduel. Transférer le surnageant contenant la suspension cellule unique à un nouveau tube.
6. Énumérer la suspension cellulaire unique en utilisant un hématocytomètre.
7. Ajuster la concentration de cellules afin de parvenir à 1,25 x 10 ⁷ levures (de survie) ou 5,0 x 10 ⁶ (UFC, de cytokines et de l'histologie) dans une suspention de <50 ul (figure 2).

4. L'administration intrapéritonéale des anticorps monoclonaux

1. Ramassez la souris par la queue et la peau du cou (figure 3A). Immobiliser la souris par la peau du cou aussi près que possible theears (assurez-vous de prendre assez de peau pour que la souris cannotturn sa tête pour mordre la personne qui le manipule; figure 3B et 3C).
2. Stabiliser le doigt withthe petite queue délicatement pressé contre la paume de la main (figure 3D).
3. Nettoyer la zone d'injection d'éthanol à 70% avant de placer l'aiguille et aspirer à regarder de sang avant l'injection.
4. Utilisez le 26G1 / 2 à piercethe peau et abdominalmuscles pour injecter la solution contenant 500μg mAb (PBS, l'anticorps isotype contrôle ou de l'anticorps monoclonal à tester, dilué dans 1 ml de PBS) en gauche thelower ou quadrant inférieur droit abdominale (cavité péritonéale), avec l'animal dans la position tête en bas, en prenant soin d'éviter les organes andother membrane interne (figure 3F).
5. Attendez un peu avant de retirer l'needleto réduire la probabilité de fuite.
6. Attendre un minimum de deux heures avant de passer à l'étape suivante.

5. L'anesthésie de la souris et les infections par voie intranasale

1. Préparer l'anesthésie avec kétamine et de xylazine à 100 mg / kg et 10 mg / kg, respectivement. Effectuer l'administration intrapéritonéale de PBS, l'anticorps isotype contrôle, ou d'anticorps expérimentaux tels que décrits dans le protocole d'accompagnement écrite. Attendre deux heures après l'injection mAb avant anesthésier la souris et de procéder à l'infection intranasale.
   
   Préparer la kétamine et de xylazine l'anesthésie à l'aide à 100 mg / kg et 10 mg / kg, respectivement (7).
   
2. Pendant la période de 2h d'attente, préparer l'inoculum capsulum Histoplasma comme décrit dans le protocole d'accompagnement écrite.
3. Procéder selon les Articles 5.1 à 5.5. Toe pincer les animaux avec une pincette et de vérifier l'absence de réflexe et de confirmer que l'anesthésie a travaillé. Après anesthésie, doucement suspendre la souris par ses dents de devant d'une chaîne de nylon ou de coton. Utilisez 2 stands colonne pour attacher les ficelles dans l'ordre de suspendre les animaux.
4. Lentement administrent environ 50 ul d'inoculum dans un nare aide d'une micropipette tout en surveillant étroitement le taux de respiration de la souris. Laissez la souris pour se reposer dans cette position pendant 2-5 min après l'infection intranasale pour faciliter le dépôt de la levure dans les poumons de l'animal (figure 3F).
5. Après la souris a été infectée, maintenir la souris dans un suivi, de l'environnement chaud (température entre 25 et 37 ° C), soigneusement en utilisant une lampe chauffante si nécessaire, jusqu'à ce qu'il récupère de l'anesthésie. Quand le réveil de la souris, c'est revenir à une cage propre avec un accès ad libitum à la nourriture et l'eau. Les cages sont retournés à notre animalerie et gardé dans une pièce les animaux purs (BLSI).

6. Études de survie

1. Évaluer les animaux infectés et infectés cliniquement maquette de la tachypnée, léthargie, obnubilation et perte de poids. Les animaux doivent être vérifiées deux fois par jour par les membres de laboratoire et quotidiennement par les animaliers.
2. Avec l'histoplasmose murin, jusqu'à la fermeture à la fin de vie, il ya généralement aucun signe apparent de l'infection autre qu'une légère augmentation de la fréquence respiratoire. Avec la maladie est avancée, ce qui arrive habituellement de 10-11 jours, les souris deviennent significativement tachypnéique et ont une activité réduite. Typiquement, ils deviennent rapidement moribond et expirer.
3. Animaux en détresse doivent être euthanasiés de manière appropriée avec le CO ₂ dans une chambre dédiée, les animaux décédés doivent être dénombrées quotidienne.

7. Études UFC, histologie et de cytokines

1. Préparer 15 ml tubes coniques de 10 ml avec du PBS pour chaque organe à être collectées.
2. Euthanasier les animaux 7 et 14 jours après l'infection avec un inuculum sublétaux (5,0 x 10 ⁶⁾ comme montré précédemment et retirez les poumons, la rate et le foie immédiatement.
3. Supprimer un morceau de l'organe à être évalués et d'effectuer la fixation dans le formol durant la nuit. Les sections seront examinés au microscope pour l'évaluation pathologique.
4. Préparer des tubes de 50 ml conique avec 5mL de PBS complété avec 70 filtres de cellules um pour chaque organe à être homogénéisé. Laisser macérer chaque portion restante des organes séparément dans le tubes de 50 ml à l'aide pistons de la seringue stérile de 5 ml.
5. Ensuite, diluer en série homogénats d'organes (1:100, 1:1000 et 1:5000) et 100 ul de chaque dilution de la plaque sur gélose BHI-sang (2).
6. Ajouter comprimés inhibiteur de protéase à l'homogénats conformément aux instructions du fabricant (Roche, Allemagne).
7. Incuber les plaques à 37 ° C pour un maximum de 14 jours et UFC énumérer.
8. Centrifuger les homogénats d'organes au 4000xg pendant 10 min et retirez surnageants orgue, whish sera utilisé dans utilisées dans les tests effectués cytokines par des méthodes standard selon le constructeur.

8. Protection anticorps monoclonal contre H. Capsulatum est dépendant de la spécificité des anticorps et Isotype

1. MAb isotype est crucial dans la protection contre H. capsulatum, comme les souris traitées avec IgG1 ou d'anticorps monoclonaux IgG2a Hsp60 ont survie significativement prolongée par rapport aux souris témoins recevant un mAb IgG2b d'Hsp60 ou soit un isotype contrôle mAb ou PBS (figure 4).
2. En outre, chez les souris qui ont reçu des Acm de protection, il y avait une réduction significative du nombre de CFU pulmonaires et spléniques au jour 7 et diminue de 2 et 2,5 unités log de numéros de levure dans les poumons au jour 14 (figure 5).

Figure 1: Croissance de H. capsulatum et hybridomes. (A) la préparation liquide HAM F-12 de la culture d'une seule colonie obtenus à partir de H. capsulatum cultivé sur une gélose BHI-sang. (B) la croissance des hybridomes dans des flacons de culture cellulaire et de purification mAb par la protéine A la chromatographie en résine / G affinité en utilisant.

Figure 2: H. préparation de l'inoculum capsulatum d'infection intranasale. Suspension cellulaire obtenue après H. capsulatum perturbations agrégats par seringue et de centrifugation est énuméré par comptage dans un hématimètre. La concentration cellulaire est ajustée à 1,25 x 10 ⁷ (expériences de survie) ou 5 x 10 ⁶ (UFC, de cytokines et de l'histologie) dans <50 ul.

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Figure 3: la manipulation de la souris lors de mAb administration. (A) La souris est capté par la queue et (B et C) immobilisé par la tenue de la peau du cou aussi proche de theears. (D) La queue est tenue entre le petit doigt et de palme. (E) La solution est injectée mAb aide d'une aiguille 26G1 / 2. (F) Le H. capsulatum inoculum est administré par voie intranasale par un léger pipetage la suspension cellulaire dans un nare.

Figure 4: MAbs d'Hsp60 peuvent altérer la pathogenèse de l'histoplasmose. injections ip avec 500 ug d'IgG1, IgG2a ou mAb 2 h avant l'infection à la survie significativement prolongée (p <0,05, par rapport aux témoins), mais un mAb IgG2b.

Figure 5: UFC déterminations dans les poumons à 7 et 14 jours après un défi sublétaux intranasale avec des levures Hc 5x10 ⁶ de souris traitées avec ip mAb choisi pour Hsp60 ou non pertinentes mAb a montré une réduction du fardeau fongique pour IgG1 et IgG2a mAbs animaux traités. Barres noires représentent UFC au jour 7 et barres blanches 14 jours post-infection (* p <0,001 à 7 jours et ** p <0,001 à 14 jours post-infection).

Discussion

Le protocole présenté ici démontre que MAB à H. capsulatum peut modifier le cours de l'histoplasmose expérimental murin. MAbs d'antigènes de surface cellulaire des pathogènes peuvent modifier la dynamique complexe qui se produisent lors de l'interaction entre un hôte et un agent pathogène. Cette étude établit que mAb intervenir dans la protection dans un modèle murin de l'histoplasmose mortelles lorsqu'elles sont injectées par voie intrapéritonéale, et il suggère protéines candidates pour le développement de vaccins, tels que H2B, antigène M (surface catalase) (3) et de Hsp60. In vivo, l'administration d'anticorps monoclonaux de protection pour Hc Hsp60 et H2B réduire le fardeau de l'organe de champignons et de l'inflammation et la survie prolongée des souris infectées.

Bien que le développement de vaccins pour H. capsulatum est un domaine passionnant de la recherche, la vaccination peut ne pas être efficace chez les personnes immunodéprimées, car ils ne peuvent pas nécessairement une réponse immunitaire d'orchestrer. Par conséquent, il est clair que cette population peut bénéficier essentiellement de thérapie passive avec mAb à H. antigènes capsulatum. Nos données suggèrent que des Acm, en particulier pour Hsp60 ou en combinaison avec d'autres anticorps monoclonaux contre des antigènes de surface cellulaire, pourrait améliorer le traitement des patients atteints d'histoplasmose (4, 6). De plus, la combinaison d'un anticorps monoclonal à H. capsulatum avec une thérapie antifongique peut être synergique et plus efficace dans l'efficacité protectrice. L'amphotéricine B est le médicament de choix et généralement utilisé pour le traitement initial de l'histoplasmose. Ainsi, l'ajout de mAb à la thérapie antifongique devrait être considérée dans les études futures. En fait, nous l'avons déjà démontré un effet synergique d'AcM à H2B et sous-inhibitrices concentrations d'amphotéricine B dans notre modèle animal (5). Par ailleurs, anticorps monoclonaux pourraient être administrés de manière prophylactique dans les foyers de l'histoplasmose, en particulier pour les personnes à risque, tels que les individus infectés par le virus de l'immunodéficience humaine ou les patients recevant des inhibiteurs du TNF-α. Les futures investigations des protecteurs mAb peut révéler d'autres renseignements importants sur la pathogenèse de l'histoplasmose et la fonction des anticorps contre H. capsulatum et, éventuellement, d'autres pathogènes intracellulaires.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biological safety cabinet (BSL2)
15 mL conical tubes	Falcon BD
HAM F-12 medium	GIBCO, by Life Technologies
37°C shaker
Vortex
50 mL conical tubes	Falcon BD
26G1/2 needle	BD Biosciences
10 mL syringe	BD Biosciences
250 mL flasks
FPLC (Fast protein liquid chromatography) system	GE Healthcare
ELISA reader	BioTek
Anesthesia (ketamine and Xylazine)
Column stands
Nylon string
Heat lamp
70μm cell strainers	Falcon BD
BHI agar plates	GIBCO, by Life Technologies