Estudos de pesquisa a doença de Lyme muitas vezes exigem a geração de carrapatos infectados com o patógeno Borrelia burgdorferi, um processo que normalmente leva várias semanas. Aqui nós demonstramos uma microinjeção baseado procedimento de infecção do carrapato que pode ser realizado em poucas horas. Nós também demonstramos um método de imunofluorescência para na localização in situ de B. burgdorferi dentro de carrapatos.
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Artigo de método
Métodos para a transferência rápida e localização de Patógenos Doença de Lyme no intestino Tick
Neste artigo
Resumo
Resumo
A doença de Lyme é causada por infecção com o patógeno espiroqueta Borrelia burgdorferi, que é mantido na natureza por um ciclo de infecção do carrapato roedor-1. Um modelo murino carrapatos 2 foi desenvolvido para estudar a doença de Lyme no laboratório. Enquanto carrapatos ingênuo pode ser infectado com B. burgdorferi, alimentando-os em camundongos infectados, o processo de muda leva várias semanas ou meses para ser concluído. Portanto, o desenvolvimento de técnicas de assinalar mais rápida e eficiente a infecção, como um procedimento de microinjeção de base, é uma importante ferramenta para o estudo da doença de Lyme 3,4. O procedimento requer apenas algumas horas para gerar os carrapatos infectados e permite o controle sobre a entrega de quantidades iguais de espiroquetas em uma coorte de carrapatos. Isto é particularmente importante como a geração de B. carrapatos infectados por burgdorferi o processo de alimentação natural, utilizando camundongos não consegue garantir a taxa de infecção de 100% e, potencialmente, resulta em variação de carga de patógenos entre os carrapatos alimentados. Além disso, a microinjeção pode ser usado para infectar carrapatos com B. burgdorferi isolados em casos em que uma cepa atenuada é incapaz de estabelecer a infecção em camundongos e, portanto, não pode ser adquirida naturalmente por carrapatos 5. Esta técnica também pode ser usado para fornecer uma variedade de outros materiais biológicos em carrapatos, por exemplo, anticorpos específicos ou dupla stranded RNA 6. Neste artigo, vamos demonstrar a microinjeção de carrapatos ninfal com in vitro-grown B. burgdorferi. Iremos também descrever um método para a localização de patógenos a doença de Lyme no intestino tick usando microscopia confocal de imunofluorescência.
Protocolo
1. Microinjeção de carrapatos Ixodes scapularis ninfal
1. Agulhas preparar
- Fabricar agulhas microinjeção várias aquecendo e puxando um milímetro tubos capilares de vidro (Instrumentos de Precisão World) em um dispositivo de vidro extrator micropipeta (Narishige). Remova cuidadosamente os tubos frágeis capilares.
- Loja puxado agulhas (com a ponta voltada para cima) em fita adesiva em uma placa de Petri.
2. Preparando B. burgdorferi
- Crescer B. burgdorferi em BSK cultura de mídia 7 até a uma concentração de cerca de 10 7 células por....
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Discussão
Aqui demonstramos um procedimento baseado microinjeção de infecção rápida e eficaz de carrapatos Ixodes ninfal com o agente patogénico B. burgdorferi. Descrevemos também um procedimento confocal de imunofluorescência para a detecção de B. burgdorferi no intestino carrapato in situ. Embora a nossa demonstração envolve gut ninfal, procedimentos semelhantes são também aplicáveis para outros estágios de desenvolvimento dos carrapatos, como larva ou adulto 8,9. No entanto, devido à sua.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Nós sinceramente agradecer aos membros do laboratório de Pal para a assistência com a preparação desta demonstração. Este estudo foi suportado por concessões PHS AI076684 e AI080615 do NIH / NIAID.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubos capilares de vidro | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-4 | |
| Puxador vertical de vidro | Narishige International | PC-10 | |
| Câmara de contagem Petroff-Hausser | Hausser Scientific | 3900 | |
| Pontas de micropipeta Microloader | Eppendorf | 930001007 | |
| Microinjetor Femtojet | Eppendorf | 920010504 | |
| Controle pedal do FemtJet | Eppendorf | 920005098 | |
| Solução salina tamponada com fosfato | Fisher Scientific | BP665-1 | Sterilizado por filtração |
Referências
- Steere, A. C., Coburn, J., Glickstein, L. The emergence of Lyme disease. J Clin Invest. 113, 1093-1101 (2004).
- Barthold, S. W., Diego, C., Philipp, M. T. Borrelia, Molecular Biology, Host Interaction and Pathogenesis. Samuels, D. S., Radolf, J. D. , Caister Academic Press. Chapter 14 353-405 (2010).
- Pal, U. ....
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