Microscopia intravital do linfonodo inguinal

Resumo

Uma técnica para a realização de microscopia intravital do linfonodo inguinal (LN) é descrito. Tal técnica permite em tempo real, In vivo Estudo da microvasculatura linfonodo e estrutura, tanto durante a homeostase e infecção. Esta técnica pode ser adaptada para estudos de células e tráfico para sites outro nó de linfa.

Resumo

Linfonodos (LN é), localizados em todo o corpo, são um componente integral do sistema imunológico. Eles servem como um local para indução de resposta imune adaptativa e, portanto, o desenvolvimento de células efetoras. Como tal, linfonodos são fundamentais para combater patógenos invasores e manter a saúde. A escolha do LN para estudar é ditada pela acessibilidade e o modelo desejado; o linfonodo inguinal é bem localizada e de fácil apóia estudos de modelos biologicamente relevantes de pele e infecção da mucosa genital.

A LN inguinal, como todos os linfonodos, tem uma rede microvascular extensa fornecê-lo com sangue. Em geral, esta rede microvascular inclui a arteríola alimentação principal da LN que, posteriormente, ramos e alimenta alta vênulas endoteliais (VEH). VHE são especializados para facilitar o tráfico de células imunes para o LN durante tanto homeostase e infecção. Como HEVs regulam o tráfico no LN em ambas as circunstâncias é uma área de intensa exploração. A LN alimentar arteríola, tem influência direta sobre o montante HEVs e é a principal fonte de nutrientes e sangue rico em células do LN. Além disso, as mudanças na arteríola alimentar estão implicados no sentido de facilitar a indução da resposta imune adaptativa. A microvasculatura LN tem uma importância óbvia para manter um suprimento de sangue ótima para o LN e regular fluxo de células imunes para o LN, que são elementos cruciais na função LN adequada e resposta imune posteriormente.

A capacidade de estudo da microvasculatura LN in vivo é a chave para elucidar como o sistema imunológico e da microvasculatura interagem e influenciam-se mutuamente dentro da LN. Aqui, apresentamos um método in vivo para a imagem do linfonodo inguinal. Nós nos concentramos em imagens da microvasculatura da LN, prestando particular atenção aos métodos que garantem o estudo dos vasos saudáveis, a capacidade de manter imagens de vasos viáveis ​​ao longo de um número de horas, e quantificação da magnitude do vaso. Métodos para a perfusão da microvasculatura com drogas vasoativas, bem como o potencial para rastrear e quantificar o tráfego celular também são apresentados.

Microscopia intravital da LN inguinal permite avaliação direta da funcionalidade microvascular e em tempo real da interface direta entre células do sistema imunológico, o LN, e da microcirculação. Esta técnica potencial para ser combinada com técnicas imunológicas muitos e rotulagem de células fluorescentes, bem como manipulado para estudar vasculatura de linfonodos outros.

Protocolo

1. Preparação do Reagente

1. Reagentes para ser usado durante todo o experimento deve ser preparado antes de iniciar o protocolo cirúrgico. Note-se que todas as soluções foram feitas utilizando técnica estéril.
2. Solução salina fisiológica (PSS) é o melhor preparado em dois componentes: solução de sal básica e solução de bicarbonato de sódio. Prepare as duas soluções em 20X de concentração e armazenar a 4 ° C. Bicarbonato de sódio a 20X é 360.0mM NaHCO ₃ (84.01g/mol) e solução de sal básica em 20X concentração é 2638.0mM NaCl (58.44g/mol), 94.0mM KCl (74.56g/mol), 40.0mM CaCl ₂ • 2H ₂ O (147.02g/mol), e 23,4 mm MgSO ₄ • 7H ₂ O (246.48g/mol). As soluções devem ser preparadas de dH ₂ O e produtos químicos devem ser adicionados um de cada vez e agitado até que a solução é clara antes de adicionar o produto químico próxima
3. Prepare 2L de PSS diluindo volumes iguais de bicarbonato de sódio e solução de sal básica e diluir para 1X concentração (por duas 2L de PSS diluir 100mL de cada solução de bicarbonato de sódio e sal básico em dH ₂ O
4. Lugar balão volumétrico de 2L contendo PSS e PSS em 37 ° C banho-maria. Equilibrar a solução com 5% de CO ₂ / gás nitrogênio equilíbrio para 1hr antes do início do procedimento cirúrgico.
5. Produtos químicos vasoativas (ex. fenilefrina, acetilcolina, nitroprussiato de sódio) são mais bem preparados na concentração de 1M em dH2O e armazenados em 100μl alíquotas a -20 ° C.

2. Preparação dos animais

1. Determinar o peso do mouse e administrar a dose inicial de pentobarbital sódico a 90mg/kg por via intraperitoneal. Durante todo o processo o mouse é continuamente monitorado para avião anestesia via pinch dedo do pé e um exame cuidadoso da freqüência respiratória. Injeções adicionais de pentobarbital sódico deve ser administrado conforme a necessidade de 20mg/kg de manter plano de anestesia. O plano cirúrgico de anestesia é mantida de acordo com os regulamentos federais e institucionais, conforme descrito no protocolo de atendimento de animais aprovado pelo Comitê Animal Care e Use (ACUC) da Universidade do Norte do BC.
2. Remover os pêlos da região abdominal e flanco / hip pela máquina de barbear. Remover restantes cabelo solto por gaze com álcool e acariciando a área com fita adesiva. Isto é suficiente como este procedimento experimental é terminal.
3. Posicione o mouse em uma placa clara cirúrgica em posição supina e anexe o mouse para a placa gravando cada pata para o conselho. Temperatura corporal é mantida através de uma lâmpada de calor externo e monitorados via termômetro retal para garantir que a hipotermia não ocorre como resultado de anestésico.

3. Procedimento Cirúrgico

1. Durante todo o procedimento cirúrgico garantir tecido exposto é sempre mantido superfused com solução equilibrada PSS aquecido. Também é importante nunca fazer o contato com a vasculatura de interesse com instrumentos cirúrgicos ou ferir os vasos, colocando a força muito sobre eles através da manipulação de tecido adiposo e tecido conjuntivo em torno deles.
2. Posicione o mouse no âmbito de dissecação. Faça uma incisão na linha média ao longo da superfície ventral da cavidade abdominal e retrair a pele para a coluna vertebral do rato.
3. Quando a pele é retirada para que a LN é facilmente visível, o pino da pele em um pedestal de Sylgard transparente 184.
4. Remover a fina camada de tecido conjuntivo sobrepondo a área ao redor do LN
5. Clara a sobreposição de tecido adiposo e cercam o nó de linfa até o leito microvascular está exposto. O principal segmento arterial estabelece adjacente ao LN e é comumente sobrepostos pela vênula. Toda a cirurgia demora cerca de 30 minutos.

4. Análise de imagem e navio

1. Uma vez que o segmento de interesse navio está exposta no âmbito de dissecação, assegurar a preparação no microscópio intravital. Note-se que animal permanece no conselho claro cirúrgica, enquanto no microscópio intravital durante toda a duração do experimento. A temperatura corporal é mantida através de lâmpada de calor e medido através de termômetro retal, conforme descrito durante a seção cirúrgica. O avião anestesia também é monitorada durante todo o experimento como descrito na seção 2.1.
2. Configure o superfusão e linhas de sucção. Superfusão do PSS ocorre por alimentação por gravidade a partir de um reservatório, no reservatório jaqueta de água aquecida (a jaqueta de água é distribuída e aquecida pelo banho de água circulante) de perfundidos por 5% de nitrogênio CO ₂ equilibrado, e para baixo uma linha de gotejamento a uma taxa de 10ml / min. A linha de sucção deve ser usado para continuar a puxar PSS superfused longe da preparação. Note-se que antes do experimento as linhas de sucção e uma jaqueta de água são cuidadosamente limpos e armazenados após cada experimento. Isso garante a esterilidade antes do próximo experimento.
3. Verifique a temperatura do PSS superfusing. Ajustar a temperatura docirculando banho de água e / ou a taxa de superfusão PSS para atingir uma temperatura de ~ 37 ° C em toda a preparação.
4. Permitir a vasculatura para equilibrar com PSS para pelo menos 60 minutos e quantificar o diâmetro do vaso usando o paquímetro de vídeo. Tipicamente, o diâmetro dos vasos deve ser determinada em vários pontos (por exemplo, em 40, 50 e 60 minutos) para garantir que o navio tenha estabilizado.
5. Avaliar a saúde do navio usando um agonista do músculo liso específica (ex. Fenilefrina, PE) e um agonista endotélio específico (ex. acetilcolina, ACh). Concentração de agonista deve ser ajustada dependendo do agonista, mas para PE e Ach o navio deve ser avaliado em cada concentração pela adição cumulativa (10-5M a 10-9M) para o superfusate. Cada aplicação agonista devem ser separados por uma fase de lavagem (normalmente 30 minutos) usando PSS, até o navio retorna ao diâmetro de descanso.
6. Após a avaliação da saúde dos vasos, após uso de drogas vasoativas, rotulagem fluorescentes e rastreamento de células experimentos podem ser realizados.
7. Após o final do experimento o animal recebe uma overdose de pentobarbital sódico. O animal é então monitorado para garantir que não há resposta para beliscar dedo do pé e falta de movimento respiratório ou batimentos cardíacos. Nesse momento esse é seguido por deslocamento cervical.

5. Resultados representativos:

Após o período de equilíbrio a preparação deve resultar em uma imagem clara que permite a identificação de ambos os arteríola e vênula que abastece o nó de linfa inguinal. Deve haver células adiposas mínima em torno dos vasos para permitir paredes da arteríola e vênula ser claramente observado para as pinças de vídeo para ser sobreposta para calcular o diâmetro dos vasos. O ponto de integrante de uma preparação bem sucedida é a arteríola tem um rico suprimento de sangue em movimento através da luz e que há um grau significativo de tom vascular (isto é, a arteríola tem a capacidade de vasoconstrição e dilatam de músculo liso e endoteliais agonistas específicos, respectivamente) .

Figura 1. Imagem de microscopia intravital de linfonodo inguinal alimentar arteríola (seta vermelha) alimentando o linfonodo equilibrada com solução salina fisiológica e correr ao lado do principal vênula (seta verde).

Figura 2. Vasoativas resposta normal à fenilefrina superfused (PE) pela adição cumulativa de soro fisiológico a partir das concentrações 10 M ^-9 a 10 ^-5 M. A presença de uma vasoconstrição robusta é sugestivo de função muscular normal liso presente na arteríola.

Figura 3. Vasoativas resposta normal à acetilcolina superfused (ACh) pela adição cumulativa de soro fisiológico das concentrações de 10 M ^-9 a 10 ^-5 M. A presença de uma vasodilatação robusta é sugestiva de apresentar função normal endotelial na arteríola.

Discussão

Microscopia intravital do linfonodo inguinal apresentado aqui fornece a capacidade de microvasculatura imagem do linfonodo in-vivo. Assim, facilita um meio de direta, a observação em tempo real. Imagem da microvasculatura LN é um site exclusivo que permite estudar a interface entre a resposta imune e da vasculatura. Usando essa preparação, o foco pode ser direcionado especificamente a resposta imune, alteração da vasculatura, ou a interação entre os dois.

Tal como acontece com todas as abordagens experimentais, microscopia intravital padrão tem vantagens e limitações. IVM padrão, tais como a preparação descrito aqui, pode ser facilmente modificado, e tem sido demonstrado anteriormente pelos autores para permitir que a microscopia de epifluorescência através da introdução de corantes traçador fluorescente ou populações de células marcadas. Embora IVM norma não dá a possibilidade de três dimensional imagem e rastreamento, como seria dada por dois fótons de microscopia ou angiografia, rastreamento de celular ainda é realizado em duas dimensões permitindo célula a célula e interação célula-vasculatura a ser observados e quantificados e em conjunto com in-vivo administração e posterior coloração com anticorpos fluorescentes podem ser usados ​​para dar dados sobre proteína / marcador de expressão em tempo real.

Nomeadamente, técnicas de imagem alternativas exigem um ambiente de estática para imagens; fixação da área cirúrgica ou a adição de uma lamela em um flat de preparação é frequentemente necessário. Isso limita, se não elimina, a capacidade de ativamente perfundir mediadores vascular ou outros sobre a preparação para avaliar a integridade vascular e fisiologia etc, ou o uso de outras técnicas, tais como vasodilatação experimentos realizados no preparo IVM. Além disso, o padrão IVM não exige uma preparação totalmente plana e não é afetado pelo movimento, como o gerado pela respiração do animal. Isto permite IVM padrão a ser usado em mais áreas cirúrgicas com maior reprodutibilidade. Isto é exemplificado pela preparação de linfonodo inguinal descrita aqui. Dado o tamanho ea forma do nó de linfa, a preparação não pode ser feita plana sem ferir o tecido ea localização do nó dá origem ao movimento significativo devido à respiração animal. Questões como seria difícil de superar por outros métodos, mas são facilmente tratada com a preparação IVM padrão descrito.

Em resumo, a preparação detalhada acima podem ser combinadas com qualquer número de outras bioquímicas, vasculares e / ou técnicas imunológicas, tais como transferência de subconjuntos de ativado ou células marcadas, a indução de hipóxia, e sobre-expressão do esgotamento de mediadores vasculares. No entanto, as aplicações adicionais são dependentes da saúde da preparação inicial. Portanto, é vital para sempre testar a saúde da vasculatura sendo fotografada e avaliada. Pontos chave para conseguir uma preparação de saúde estão garantindo a preparação é constante perfundidos com PSS equilibrada a temperatura corporal e minimizando o contato e estresse colocado na área cirúrgica durante a cirurgia.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia
Bicarbonato de sódio	Sigma Aldrich
Cloreto de sódio	Sigma Aldrich
Cloreto de Potássio	Sigma Aldrich
Cloreto de cálcio dihidratado	Sigma Aldrich
Nitroprussiato de sódio	Sigma Aldrich
Fenilefrina	Sigma Aldrich
Acetilcolina	Sigma Aldrich
Cloreto de magnésio hepta-hidratado	Sigma Aldrich
Sódio Pentobarbitol