Ortotópico do xeno-Human-luciferase Tagged maligna dos nervos periféricos Células Tumorais Bainha para In vivo Teste de Agentes Terapêuticos candidatos

Resumo

Um método para enxertia confiável luciferase marcadas humana maligna dos nervos periféricos células tumorais em bainha do nervo ciático de ratos imunodeficientes é descrito. A utilização de imagem de bioluminescência para demonstrar estabelecimento adequado de enxertos tumor e critérios para a segregação aleatória dos animais em grupos de estudo são também discutidos.

Resumo

Embora em telas vitro são essenciais para a identificação inicial de agentes terapêuticos candidato, uma avaliação rigorosa da capacidade da droga para inibir o crescimento do tumor deve ser realizado em um modelo animal adequado. O tipo de modelo animal que é melhor para esta finalidade é um tema de intensa discussão. Algumas evidências indicam que estudos pré-clínicos de examinar os efeitos da droga em tumores que surjam em camundongos transgênicos são mais preditivo do resultado clínico ¹ e assim por agentes candidato terapêuticas são frequentemente testados nesses modelos. Infelizmente, os modelos transgênicos não estão disponíveis para vários tipos de tumor. Além disso, os modelos transgênicos têm, frequentemente, outras limitações, tais como preocupações sobre a forma como os modelos bem tumor do mouse seu homólogo humano, penetrância incompleta do fenótipo do tumor e uma incapacidade de prever quando irá desenvolver tumores.

Conseqüentemente, muitos pesquisadores utilizam modelos xenoenxerto (células tumorais humanas enxertados em camundongos imunodeficientes) para os ensaios pré-clínicos, se necessário modelos de tumor transgênicos não estão disponíveis. Mesmo os modelos transgênicos estão disponíveis, são muitas vezes em parceria com modelos como o último xenoenxerto facilitar a determinação rápida de faixas terapêuticas. Além disso, esta parceria permite uma comparação da eficácia do agente em tumores transgênicos e genuíno células tumorais humanas. Historicamente, xeno tem sido muitas vezes realizada através da injeção de células tumorais por via subcutânea (xenoenxertos ectópica). Esta técnica é rápida e reprodutível, relativamente barata e permite a quantificação contínua de crescimento do tumor durante o período terapêutico ^2. No entanto, o espaço subcutâneo não é o microambiente normal para a maioria neoplasias e por isso os resultados obtidos com xeno ectópica pode ser enganadora, devido a fatores como a ausência de órgãos específicos expressão do tecido do hospedeiro e dos genes do tumor. Foi assim fortemente recomendado que ectópica estudos de enxertia ser substituídos ou complementados por estudos em que as células tumorais humanas são enxertados em seu tecido de origem (xeno ortotópico) ^2. Infelizmente, a implementação desta recomendação é muitas vezes frustrada pelo fato de que ortotópico metodologias xeno ainda não foram desenvolvidos para vários tipos de tumor.

Tumores malignos da bainha dos nervos periféricos (MPNSTs) são sarcomas altamente agressivos que ocorrem esporadicamente ou em associação com neurofibromatose tipo 1 ³ e mais comumente surgem no nervo ciático ^4. Aqui nós descrevemos um método tecnicamente simples em que firefly luciferase marcadas MPNST células humanas são orthopically xenografted no nervo ciático de ratos imunodeficientes. Nossa abordagem para avaliar o sucesso do procedimento de enxerto em animais individuais e randomização não-tendenciosa subseqüentes em grupos de estudo também é discutida.

Protocolo

1. Preparação inicial de não-nu camundongos imunodeficientes (não é necessário para Cepas Nudez):

1. Todos os procedimentos foram revistos e aprovados previamente pelo Animal Care UAB Institucional e Comitê de Uso e conduzido por pessoal devidamente treinado. Temos utilizado com sucesso três linhagens de camundongos imunodeficientes para estas experiências: a Foxchase) outbred camundongos SCID (CB17/lcr- Prkdc ^scid / lcrCrl ratos); b) NIH III camundongos (NIHS-Lyst ^bg Foxn1 ^nu camundongos Brk ^xid), e c ) NOD-SCIDγ camundongos (NOD.Cg-Prkdc ^scid Il2rg ^tm1Wjl / SzJ ratos). Em nossas mãos, o crescimento de xenoenxertos ortotópico é praticamente idêntico no NIH III e NOD-SCIDγ ratos, os quais carregam mutações que afetam a função das células T, células B e células NK; para este protocolo, o número de dias necessários para o enxerto crescimento, o momento em que a terapia é iniciada e os tempos pós-enxerto, quando é realizada de imagem são os que temos empiricamente determinada usando NOD SCIDγ-ratos. Crescimento do enxerto em camundongos SCID Foxchase outbred, que têm defeitos de T e função de células B, normalmente leva mais tempo.
2. Para facilitar a enxertia de um grande número de não-nu camundongos imunodeficientes, nós remover pêlos de sítio cirúrgico na tarde anterior à enxertia. Os ratos são anestesiados utilizando uma câmara de indução isoflurano anexado a um vaporizador com scavenge para o gás residual. Para manter a temperatura corporal, os animais são tratados em uma almofada de aquecimento em todo este processo. Clippers são usados ​​para remover os pêlos do baixo meados de volta para o joelho da perna do lado que está a ser enxertada. Qualquer cabelo restante é cuidadosamente removido do site em ~ 5 minutos usando um agente químico depilatórios (por exemplo, Nair, em um determinado produto com aloe vera para a pele sensível). Remoção do produto depilatório é recomendado, pois pode levar a irritação da pele, olhos e superfícies outro organismo ao qual ele pode se espalhar. Nós não enxerto de ambos os nervos ciático nesses experimentos, pois isso pode prejudicar a função hindleg bilateralmente, resultando na perda de ratos dos grupos de estudo.
3. Ratos têm permissão para se recuperar totalmente de uma almofada de aquecimento em uma gaiola isolada, sem cama, o que garante que tanto os ratos não são feridos por outros, mais animais totalmente alerta e impede que eles acidentalmente inalar cama. Quando os ratos são totalmente móveis e não mostram evidência de grogginess, podem ser reintroduzidos em uma gaiola com outros ratos.

2. Preparação de células MPNST para injeção no Dia da Enxertia

1. Neste protocolo, os números específicos de células enxertadas e os tempos necessários para o crescimento do tumor pós-enxertos são aqueles que temos empiricamente determinado para ST88-14 células, uma linha comumente usado MPNST que foi derivada de um tumor NF1 associados ^5. As células que nós usamos para enxerto foram transduzidas com um vetor lentiviral contendo um cassete de CMV-luciferase-IRES-puromicina e clones expressando estavelmente firefly luciferase identificado por bioluminescência imagem ^6. Temos também realizou experimentos com enxertos de células transfectadas estavelmente MPNST com plasmídeos expressando firefly luciferase sob o controle do promotor CMV imediata cedo. Nós não recomendamos essa que temos encontrado que estes vetores plasmídeo são propensas a sofrer extinção da seguinte expressão enxertia.
2. ST88-14 células são cultivadas em meio mínimo Dulbecco é essencial suplementado com 10% de soro fetal bovino, 10 estreptomicina mcg / mL e 10 UI / mL penicilina (DMEM10), 5 puromicina mcg / ml também está incluído para manter a seleção para o vetor lentiviral. Temos mantido essas células em nosso laboratório por 50 passagens e não observaram qualquer variação no crescimento celular em qualquer destas passagens. 9 x 10 ⁵ células ST88-14 são banhados em um frasco T175 e cresceu durante 3 dias, altura em que o frasco é de aproximadamente 80% confluentes. Para enxerto 35 ratos, um único frasco de 80% T175 confluentes é necessária; nesta densidade, o nosso rendimento médio da ST88-14 células é de 7,3 x 10 ⁶ células por T175 frasco. É extremamente importante que as células não ser permitido a crescer a confluência antes da colheita para enxertia. Nós descobrimos que as células do miocárdio a partir dos resultados colhidos em frascos confluentes um maior grau de falência do enxerto e, muitas vezes prolonga o curso vivo no de crescimento do enxerto.
3. ST88-14 células são lavadas uma vez com a solução à temperatura ambiente Hanks salina balanceada. As células são retiradas do frasco usando celular Stripper célula dissociação solução por 30 segundos a 1 minuto à temperatura ambiente. Cinco mililitros de DMEM10 (Nota: puromicina não está incluído neste meio) por cada mililitro de Stripper célula utilizados são então adicionados às células.
4. As células são contadas usando um hemocitômetro. 5 x 10 ³ células ST88-14 em suspensão em 3 mL será injetado por mouse. A quantidade de células suficientes para enxerto de toda a coorte, com subsídio para pipetagemerro (por exemplo, por 35 ratos, que normalmente transferir um número de células suficientes para enxerto de 40 ratos), é transferido para um tubo estéril 1,5 mL. As células são centrifugadas a 3000 rpm por 5 minutos. O sobrenadante é cuidadosamente removido eo pellet celular ressuspenso em DMEM10 (Nota: puromicina não está incluído neste meio) para uma concentração final de 5 x 10 ³ células por 3 mL. Manter as células no gelo.

3. Enxerto Protocolo

1. Os ratos são anestesiados na câmara de indução de um vaporizador de isoflurano até que já não retirar o seu membro posterior a um estímulo pitada dedo do pé. Os ratos são colocados do lado deles e administrado por via subcutânea com 0,05 mg / kg de buprenorfina hydrocholoride. A anestesia é então mantida pela administração contínua de isoflurano entregues via nariz cone. Por favor, note que uma camundongos sacrificados foi usado para demonstrar este procedimento para o vídeo e, conseqüentemente, a tubulação isoflurano usado para entregar o isoflurano não é visível no vídeo.
2. Para manter a temperatura corporal, os animais são tratados em uma almofada de aquecimento durante todo o processo de enxertia. Para evitar ressecamento da córnea, uma pequena gota de pomada oftálmica (Puralube pomada veterinária) é administrado para cada olho. Como será necessário para cada rato para ser identificado exclusivamente durante o julgamento, uma marca auricular com um número identificador único é cortado para a orelha direita de cada rato.
3. Coloque o animal no estômago, espalhando patas traseiras. Cobrir o mouse com uma cortina estéreis, expondo a janela cirúrgica (flanco), onde irá ocorrer de enxertia. A cortina estéreis devem permitir a visualização da cabeça, tanto para garantir que o nariz ainda está dentro do cone e para permitir o monitoramento da respiração e da cor do animal. Aplicar betadine para o local da cirurgia com um aplicador derrubado algodão, começando no centro do flanco e, gradualmente, em espiral para fora, para as bordas da janela cirúrgica. Etanol 70% é então aplicado ao local da cirurgia da mesma maneira. Aplicações consecutivas de betadine seguido pelo etanol são repetidas mais duas vezes.
4. Remove as células de gelo e quer gentilmente vórtice ou apertar o tubo para ressuspender as células resolvido. Com uma pipeta, 3,2 mL remover da suspensão de células e ejetá-lo sobre um pedaço de Parafilm. Ao remover mais do que o necessário e colocar a suspensão na Parafilm, podemos assegurar que não há bolhas na suspensão e que temos uma mL 3 cheio para a injecção. Puxe o máximo da suspensão de células possível para uma seringa Hamilton de 10 L equipada com uma agulha de calibre 33. Flick bolhas da seringa e expelir o excesso de suspensão de células a exatamente mL 3. Segure as células ea seringa contendo células em gelo até estar pronto para uso; para garantir que a agulha permanece estéril, não permitem o contato com o gelo ou o balde. Um pedaço de saran wrap pode ser colocado em cima do gelo para a seringa diretamente em contato com o gelo.
5. Usando um No. 4 lidar com bisturi equipado com um 22 º lâmina de bisturi, fazer uma incisão através da pele do flanco logo abaixo e paralelo ao fêmur, certifique-se que a incisão não se estende além dos limites do campo cirúrgico limpo. Abrir a incisão na pele com uma pinça cirúrgica ou manualmente para expor o músculo subjacente. Um avião fascial será visível em execução ao longo do comprimento da perna, o nervo ciático se encontra abaixo deste e entre os dois músculos ligados pela fáscia. Usando um par de tesouras de ponta aguçada, sem corte dissecar através deste fascia para expor o nervo ciático, que deve ser aparente como uma estrutura linear branco sobre a espessura de um fio grosso.
6. Usando um par de pinças de ponta aguçada curvas, dissecar cuidadosamente sob o nervo, liberando-a do músculo subjacente, o que eleva tanto e isola o nervo. Deixe o fórceps sob a coragem de manter esta posição. Insira cuidadosamente a agulha da seringa Hamilton no nervo, tentando manter o ângulo de injeção como paralelo com o nervo possível para que a agulha não perfure através da parte inferior do nervo. A agulha deve ser inserida no final do nervo distal à espinha-descobrimos que a injeção de células tumorais no nervo em direção à medula espinhal estabelece as células do tumor enxertados em estreita proximidade com a medula espinhal. Quando isso ocorre, as células do tumor, muitas vezes invadem a medula espinhal, resultando em perda prematura do animal a partir do grupo de estudo devido ao comprometimento da função da medula espinhal.
7. Uma vez que a agulha esteja posicionada corretamente no nervo, relaxar a tensão produzida no nervo do fórceps e injectar lentamente as células da seringa para o nervo mais de 45-60 segundos. É essencial que isso seja feito devagar, tão rapidamente a expulsão do conteúdo da seringa irá resultar em um "back wash-" das células tumorais ao redor do local da injeção e sua perda. Depois de todas as células foram injetadas com sucesso, retirar a agulha lentamente para minimizar a perda do material injetado.
8. Para remover oceps e coloque cuidadosamente nervosas de volta para sua posição original sob o músculo. Feche a incisão cirúrgica com cola cirúrgica Vetbond. Segure incisão junto com uma pinça por aproximadamente 20 segundos para permitir que a cola secar.
9. O mouse é removido do isoflurano nariz cone e colocado sozinho em uma gaiola cama livre para se recuperar. Esta gaiola deve ser mantido no topo de uma almofada de aquecimento até que o animal esteja completamente recuperado. Parte da gaiola de recuperação não deve ser sobre uma almofada de aquecimento, isto permite que o animal a afastar-se do calor, se ficar muito quente. Após enxertia, os animais devem ser avaliados regularmente para mastigar no local, claudicação ou anorexia; estes sinais podem indicar que o animal ainda está em dor e analgésicos que apropriado deve ser dado. Depois de ganhar experiência com este procedimento, descobrimos que os ratos 30-40 pode ser facilmente enxertados em um único dia.

4. Avaliação do sucesso do enxerto e randomização em grupos de estudo

1. Imagem de bioluminescência é utilizado para avaliar o sucesso do processo de enxertia. Usamos um sistema de IVIS-100 (originalmente de Xenogen, que agora é conhecido como Calipers Inc.) para detectar a emissão de luz de tumor expressos luciferase do firefly que é produzido como resultado da reação química de luciferase com seu substrato, D-Luciferina . As análises destas imagens específicas determinar se os ratos enxertados são adequados para a entrada no coortes ensaio terapêutico. Em experimentos preliminares, temos quantificados os sinais de bioluminescência detectável, sacrificaram ratos enxertados, colhidos seus tumores e correlacionados pesos tumor com os sinais de bioluminescência de região de análises interesse usando o fabricante do Software imagem viva. Estes estudos demonstraram que havia uma correlação linear entre o peso do tumor e enxerto de emissão de luz bioluminescência, indicando que a imagem de bioluminescência é um meio adequado substituto de avaliar o crescimento xenoenxerto durante todo o curso de ensaios pré-clínicos. Tipicamente imagem que cinco camundongos, ao mesmo tempo. Detalhes adicionais sobre imagem de bioluminescência foram publicados anteriormente ^7.
2. Para avaliar o sucesso do enxerto, a imagem de bioluminescência é realizada 1 e 3 dias de pós-enxertia. As imagens são coletadas de ratos orientado na mesma posição 10 min após a injeção intraperitoneal de 2,5 mg D-Luciferina. Durante a gravação, os ratos são mantidos sob anestesia com isoflurano e sua temperatura corporal mantida a 37 ° C por uma almofada de aquecimento presente no imager Xenogen. Tempos de aquisição de imagem estão na faixa de 2 segundos a 10 minutos, o software de aquisição de dados assegura que nenhum pixel estão saturados durante a coleta de imagem. Emissão de luz das regiões tumor (contagens de fótons relativa / sec) é medida usando software proprietário de Xenogen. Intensidade de emissão de luz é representada por escalar pseudo da bioluminescência, que é sobreposto em fotografias em preto e branco dos ratos que são coletados ao mesmo tempo.
3. Para ser elegível para inclusão em uma coorte experimental pré-clínico, os ratos devem ter um sinal de bioluminescência detectável tanto 1 e 3 dias pós-enxerto e da intensidade do sinal de bioluminescência deve aumentar entre os dias 1 e 3. Animais que tenham um sinal de diminuição ou estáticos são excluídos. Além disso, os sinais detectados em ratos enxertados no mesmo dia deve estar dentro de uma ordem de grandeza de cada um; camundongos com sinais de bioluminescência que são uma ordem de magnitude maior ou menor do que os detectados em animais enxertados no mesmo dia também são excluídos.
4. Uma vez que os ratos foram identificados que atendem a esses critérios, eles devem ser divididos aleatoriamente em grupos de tratamento. Para alcançar este objectivo, os sinais de luciferase detectado em ratos enxertados três dias pós-enxerto são primeiro ordenado maior para o menor intensidade. Ratos são, então, randomizados em grupos, atribuindo-lhes, por ordem de intensidade para os grupos de tratamento, revertendo essa ordem e, em seguida, repetindo o processo até que todos os ratos são atribuídos a grupos. Por exemplo, se existem 4 grupos de tratamento (por exemplo, placebo, e três concentrações de droga teste) ratos são atribuídos aos grupos na ordem 1, 2, 3, 4, 4, 3, 2, 1, 1, 2, 3 , 4, 4, 3, 2, 1 .. etc Antes de iniciar o tratamento, os sinais de bioluminescência detectadas em cada membro do grupo atribuídas são em média para se certificar de que os sinais média de partida dentro de todos os grupos são o mais próximo possível. Administração do agente terapêutico é candidato começou no dia 3.
5. Para avaliar o efeito do agente terapêutico tem sobre o crescimento do enxerto durante o curso do tratamento, a imagem latente da bioluminescência é realizada uma vez por semana após o início da terapia (dias 10, 17, 24, 30 pós-enxertia). Para não-nu camundongos imunodeficientes, é extremamente importante que os animais novamente ter crescimento de pele nova removido com Nair antes de executar cada sessão de imagem. Isso é porque o cabelo blocos sinais bioluminescentes, com a cor da pelagem determinar o quanto do sinal é perdido. Por exemplo, a pele branca, como é encontrado na Suíça Webster ratos produz uma redução de 18% na intensidade do sinal bioluminescente ^8, enquanto a pele preta pode diminuir os sinais em até 10 vezes ^9. Gostaríamos também de notar que não se pode presumir que regrowth pele uniforme vai ocorrer em todos os grupos de tratamento e "normalizar" as reduções de sinal entre os grupos de tratamento. Isso ocorre porque o agente terapêutico em si pode afetar o crescimento do cabelo. Por exemplo, temos observado que o tratamento com tamoxifeno inibe crescimento do cabelo, minimizando assim o efeito percebido desse agente no crescimento do tumor quando comparado ao placebo camundongos tratados.
6. Com células ST88-14 MPNST, os camundongos podem ser realizadas por 30 dias pós-enxerto. Neste momento, os tumores geralmente têm crescido ao tamanho máximo permitido pelo cuidado animal institucional e comitês de uso e deve ser sacrificado. Após a sessão de imagem final, os ratos são mortos e amostras necessárias para análise dos resultados do tratamento (por exemplo, de sangue para determinação dos níveis circulantes do agente terapêutico, o tecido tumoral para determinação do peso, o exame de histologia, determinação de índices de Ki67 e rotulagem TUNEL e avaliação dos parâmetros bioquímicos) coletados. Precisamente o que as amostras são coletadas dependerá das necessidades do projeto experimental.
7. Camundongos com tumores devem ser monitorados diariamente e terminou se eles ficam doentes (aliciamento falta normal e comportamentos de evitação), são incapazes de comer ou beber, ou se o tumor se torna excessivamente grande de dificultar o movimento do corpo normal. Carga tumoral não deve ser permitido exceder 10% do peso corporal do animal normal. Peso do tumor em percentagem do peso corporal é calculado através da comparação do peso dos animais com tumor ao peso da idade / sexo animais controle pareado. Caquexia não deve ser permitida a tornar-se clinicamente significativo. Perda de peso em animais portadores de tumor não deve exceder 20% do peso corporal normal.

5. Resultados representativos:

A figura 1 ilustra o aumento progressiva usual bioluminescência observada 1 a 18 dias pós-enxerto em um xenoenxerto devidamente estabelecidos ortotópico em um nu (NIH III) mouse (AC). Quantificação dos sinais de bioluminescência observada 1-24 dias após a enxertia mostra que, embora estes sinais aumentam progressivamente, o crescimento do tumor acelera acentuadamente nos últimos estágios do período de estudo (Figura 1D). Rigorosamente demonstrar que o crescimento do tumor ocorreu em camundongos enxertadas, que recolhem o nervo ciático e, se se verificar que o tumor se rompeu epineuro e invadiu tecidos adjacentes, em torno dos tecidos moles e músculo esquelético. Dado o crescimento agressivo de MPNSTs, não é de estranhar que muitas vezes achamos que as células do tumor enxertados ter violado as barreiras normal do nervo e invadiu tecidos adjacentes (Figura 1E). Também muitas vezes achamos que as células enxertadas MPNST migrar agressivamente no nervo proximal e distal ao local do enxerto.

Figura 1. Imagem de bioluminescência NIH III do mouse ortotopicamente enxertado com luciferase marcadas células MPNST um dia pós-enxerto (A). Note que os sinais detectados na região de interesse (ROI) em camundongos diferentes estão todos dentro de uma ordem de grandeza do outro. Recriação de 10 dias (B) e 18 dias (C) pós-enxerto mostra que os sinais bioluminescentes aumentar progressivamente no local do enxerto em camundongos individual. (D) Gráfico ilustrando o aumento progressivo do fóton em relação contagens / segundo detectados ao longo do local do enxerto 1-24 dias pós-enxerto. (E) Fotomicrografia do local do enxerto a partir deste rato demonstrando o crescimento do tumor e invasão focal em músculo esquelético adjacente.

Discussão

O método ortotópico detalhada xeno aqui apresentado é aquele que desenvolvemos usando células ST88-14 MPNST, uma linha que é amplamente utilizado em estudos desses NF1 associada tumores de bainha de nervo periférico. No entanto, essa metodologia é facilmente adaptável para os estudos pré-clínicos com outras linhagens de células MPNST. Por exemplo, temos também realizada ortotópico xeno com STS-26T ¹⁰ células, uma linha derivada de uma MPNST esporadicamente ocorrendo e T265-2c ¹¹ células, que são derivados de uma MPNST NF1-associados, com sucesso semelhante ao que observamos com ST88 -14 células.

Dito isto, gostaríamos de observar que as condições exatas que descrevemos aqui para ortotópico xeno-enxerto de células ST88-14 não podem ser diretamente adotado para a enxertia de linhas MPNST outros. Em vez disso, os parâmetros-chave da metodologia deve ser determinado empiricamente para cada linhagem celular. Estes parâmetros incluem o número de células inicialmente MPNST enxertadas, o prazo concedido para o desenvolvimento do enxerto e, em menor grau, o volume em que as células do tumor são injetados. Para estabelecer esses parâmetros para uma nova linha, que grupos de enxerto de camundongos (5 ratos por grupo) com ^outubro 03-05 x 10 ⁶ células tumorais, verificando duas concentrações de células para cada ordem de grandeza (ie, 10 ³ células, 5 x 10 ³ células, 10 ⁴ células, 5 x 10 ⁴ células, etc.) Maior número de células tumorais (> 10 ⁶⁾ deve ser injetado em um maior volume; descobrimos que até 5 mL podem ser injetadas sem perda de células do nervo enxertado. Temos também descobriu que não mais que 5 x 10 ⁶ células tumorais por 5 mL de volume pode ser injetado como suspensões mais denso tornar-se cada vez mais propenso a tesoura que mata as células do tumor. Nós seguimos estes ratos até pelo menos três animais dentro de cada grupo têm tumores palpáveis, em que ponto nós pôr termo a esse grupo e examinar o nervo histologicamente para confirmar o crescimento do enxerto. Obviamente, o tempo necessário para chegar a este ponto será diferente, dependendo do número de células injetadas, em geral, estamos buscando uma concentração de células que irá atingir o crescimento tumoral máxima permitida dentro de 30-60 dias. Crescimento mais rápido pode tornar difícil para alcançar concentrações terapêuticas eficazes antes do término do experimento e / ou evitar o acúmulo de pontos de dados de imagem de bioluminescência suficiente ao longo dos experimentos. Um curso de tempo superior a 60 dias faz ajustando os parâmetros experimentais pesadas e prolonga desnecessariamente a duração dos experimentos planejados.

Finalmente, gostaríamos de observar também que temos utilizado esta metodologia ortotópico xeno com ST88-14 células enxertadas em camundongos NIH III para demonstrar a eficácia terapêutica do tamoxifeno ^6. Uma descrição detalhada dos métodos que usam rotineiramente para avaliar os efeitos de agentes terapêuticos candidato em xenoenxertos ortotópico pode ser encontrado nesse manuscrito. Também tem sido demonstrado que as células neurofibroma pode ser enxertadas com sucesso em nervo periférico ^12, sugerindo que, com modificações, os procedimentos descritos neste protocolo pode ser usado para realizar ensaios pré-clínicos com agentes terapêuticos dirigidos contra candidato neurofibromas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Camundongos SCID outbred Foxchase	Charles River Laboratories	#236
Camundongos NIH III	Taconic	#NIHBNX
Camundongos NOD-SCIDγ	Jackson Laboratory	#005557
Cell Stripper	Fisher Scientific	25-056-cl
Cola cirúrgica Vetbond	3M	1469SB
Seringa Hamilton	Hamilton Co	#80030	volume de 10 μL
Agulhas para seringa Hamilton	Hamilton Co	#7803-05	33 Ga., 0,5 polegada, PT4 (fabricado sob encomenda)
Chips de orelha	National Band and Ear Tag Co.	1005-1
Pomada oftálmica	Dechra	NDC 17033-211-38