Mudanças Dinâmicas de monitoramento dos níveis de cálcio mitocondrial durante a apoptose através de um sensor de cálcio geneticamente codificado

Summary

Este protocolo descreve um método para medição em tempo real dos fluxos de cálcio mitocondrial por imagem fluorescente. O método se aproveita de uma circular permutated sensor de cálcio YFP baseado excitação dupla raciométrica (raciométrica pericam-mt) seletivamente expressos na mitocôndria.

Abstract

Mudanças dinâmicas na concentração de cálcio intracelular em resposta a vários estímulos regula muitos processos celulares como a proliferação, diferenciação e apoptose ^1. Durante a apoptose acúmulo de cálcio, na mitocôndria promove a liberação de fatores pró-apoptóticos da mitocôndria para o citosol ^2. É, portanto, de interesse para medir diretamente cálcio mitocondrial em células vivas in situ durante a apoptose. Alta resolução de imagem fluorescente de células carregadas de excitação dupla raciométrica e não raciométrica corantes indicador sintético de cálcio tem sido provado ser uma ferramenta confiável e versátil para estudar vários aspectos da sinalização do cálcio intracelular. Medir os fluxos de cálcio citosólico utilizando estas técnicas é relativamente simples. No entanto, medindo os níveis de cálcio nas células intactas intramitocondrial utilizando indicadores de cálcio sintéticos como Rhod-2 e Rhod-FF é mais desafiador. Indicadores sintéticos direcionados para as mitocôndrias têm embotado respostas repetitivas a um aumento no cálcio mitocondrial, e interromper a morfologia mitocondrial ^3. Além disso, indicadores sintéticos tendem a vazar para fora da mitocôndria durante várias horas o que os torna inadequados para experimentos de longa duração. Assim, os indicadores de cálcio geneticamente codificado com base em proteína fluorescente verde (GFP) ⁴ ou ⁵ aequorin direcionados para as mitocôndrias têm muito facilitada medição da dinâmica do cálcio mitocondrial. Aqui, descrevemos um método simples para medição em tempo real dos fluxos de cálcio mitocondrial em resposta a estímulos diferentes. O método é baseado em microscopia de fluorescência de 'raciométrica-pericam ", que é seletivamente direcionados para as mitocôndrias. Pericam raciométrica é um indicador de cálcio baseado em uma fusão de circularmente permutados proteína fluorescente amarela e calmodulina ^4. A ligação do cálcio para pericam raciométrica provoca uma mudança de seu pico de excitação de 415 nm a 494 nm, enquanto que o espectro de emissão, que picos em torno de 515 nm, permanece inalterado. Raciométrica pericam liga um íon de cálcio com uma única constante de dissociação in vitro de ~ 1,7 mM ^4. Estas propriedades do pericam raciométrica permitem a quantificação de mudanças rápidas e de longo prazo na concentração de cálcio mitocondrial. Além disso, descrevemos a adaptação desta metodologia a um padrão de imagem do microscópio de campo amplo de cálcio com comumente disponíveis conjuntos de filtros. Usando dois agonistas distintos, o agonista purinérgico ATP e indução de apoptose estaurosporina de drogas, demonstram que este método é apropriado para monitorar mudanças na concentração de cálcio mitocondrial com uma resolução temporal de segundos a horas. Além disso, também demonstram que pericam raciométrica também é útil para medir a fissão mitocondrial / fragmentação durante a apoptose. Assim, pericam raciométrica é particularmente adequado para a medição contínua de longo prazo da dinâmica do cálcio mitocondrial durante a apoptose.

Protocol

1. Pericam-mt Transfection e Preparação Cell.

1. Células HeLa placa na noite anterior transfecção em lamínulas estéreis colocados em uma placa de cultura padrão de 6 poços.
2. Prepare DNA / 2000 Lipofectamine complexos, como sugerido pelo fabricante (Invitrogen). Nós usamos 4 mg de raciométrica-pericam-mt vetor de expressão e de 10 mL de 2000 Lipofectamine diluído em 0,5 mL de Opti-MEM para cada poço. As células devem ser confluentes ~ 70% antes de transfecção.
3. Substituir HeLa cultura da mídia (modificado Dulbecco águias médio, 10% de SFB, penicilina / estreptomicina) em cada poço com 1,5 mL do mesmo meio sem antibióticos.
4. Adicionar os complexos DNA / Lipofectamine a cada poço a ser transfectadas. Misture delicadamente com balanço e incubar por quatro horas em uma cela cultura incubadora a 37 ^o C, 5% CO _2.
5. Substituir antibióticos de mídia livre com meios de cultura com antibióticos. Permitem que as células para expressar pericam raciométrica por 1-2 dias antes da imagem.

2. Setup microscópio e Aquisição de Imagem

1. Coloque uma lamela com células HeLa em uma câmara de imagem apropriado com solução de imagem: 107mm NaCl, KCl 7.2mm, 1.2mm MgCl _2, 1 mM CaCl _2, 11,5 mm de glicose, 0,1% de albumina bovina sérica e HEPES 20mM 7.2. Nosso laboratório utiliza a câmara de célula Attofluor da Invitrogen. Monte a câmara de imagem em um estágio do microscópio invertido.
2. Encontrar uma área de interesse contendo uma ou mais células que expressam pericam raciométrica usando um 40x (ou superior) objetiva de imersão em óleo. Descobrimos que pericam proporcional está menos resistentes à fotodegradação a 380 nm e, assim, usar esse comprimento de onda para identificar células adequado. Para as imagens obtidas na Figura 1, a Nikon objetivo Superfluor 40X com uma abertura numérica 1,3 foi utilizado. Objetivos maior ampliação também seria apropriado (60-100x). Filtros de excitação utilizadas foram Chroma Tecnologia filtros D380/30x (380 + / - 30 nm) e D495/10 (495 + / - 5 nm), refletores foi 505DCXR (505nm longpass), e emissão de filtro foi HQ535/50m (535 + / - 25nm).
   Nosso microscópio usado para adquirir as imagens na Figura 1 consiste de um microscópio invertido Nikon TE2000 equipado com um Roper Scientific Coolsnap HQ resfriado câmera CCD, Ludl MAC6000 rápida roda de filtros e changer, e um MetaFluor aquisição de dados e software de análise. Este protocolo pode ser adaptado a qualquer microscópio de campo amplo padrão com os filtros adequados e software capaz de capturar e processar imagens raciométrica.
3. Configurar o software para a excitação dupla usando o 495 e 380 nm filtros. Cálcio ligação a pericam raciométrica aumenta a absorvância a 495 nm, assim, a relação deve ser configurado para ser 495 nm/380 nm.
   Raciométrica pericam tem um pico de cálcio livre de excitação em 415 nm ^4. Neste protocolo, sugerimos usar um filtro de 380 nm só porque ele é onipresente na maioria dos laboratórios de imagem de cálcio. Se um filtro de 410 nm está disponível, é preferível o filtro nm 380.
4. Adquirir imagens sequencialmente por alternativamente emocionante em 495 e 380 nm. Adquirir imagens dos níveis de cálcio de base por pelo menos 30 s antes da aplicação do agonista através de um aparelho de perfusão. Marcar o tempo de adição para cada agonista. Tempos de exposição e os intervalos de aquisição deve ser otimizado para evitar fotobranqueamento enquanto ainda permitindo exemplo resolution.For suficiente temporal, para a dinâmica de semi-rápidas de cálcio monitorados em resposta à estimulação agonista, imagens foram adquiridas a cada dois segundos nas Figuras 1B e taxas C. Muito mais rápido aquisição Também é possível ^6. Longo prazo de imagens após a administração estaurosporina foi adquirido com um intervalo mais longo (30s) entre as aquisições (Figura 1 D e E).

3. Processamento de Imagem e Análise

1. Uma vez que a experiência é completa, imagens obtidas podem ser analisadas offline. Definir as regiões de interesse (ROI) em que você deseja monitorar mudanças nos níveis de cálcio. Use um ROI selecionada dentro de uma área vazia do campo para subtrair fundo, se necessário. Note-se que as mitocôndrias são bastante móveis e dinâmicos, e eventos extrapolando em uma única mitocôndria durante longos períodos nem sempre é possível. Assim, considerando a alta motilidade dessa organela em alguns tipos de células, a seleção de ROI devem ser cuidadosamente monitorizados. Além disso, como evidenciado na Figura 1, a resposta mitocôndrias heterogeneamente a vários estímulos. Portanto, é importante para analisar os dados offline e monitorar RO1 colocação em uma base quadro-a-quadro. A descrição detalhada de medição de cálcio mitocondrial em alta motilidade mitocôndrias tem sido descrito em outros lugares ^7.
2. Medições obtidas a partir do ROI pode ser importado para o Excel ou graphingsoftware similar. Os dados podem ser apresentados como um traço que representa as alterações nos níveis de cálcio mitocondrial em uma única célula ou mitocôndria única, ou uma média de fluorescence sinais de ROI diversas. Temos também utilizado esta técnica para medir os níveis de cálcio média mitocondrial em uma população de linfócitos em apoptose induzida pelo Fas ligante ^8.

4. Resultados representativos:

Figura 1. (A) localização subcelular de raciométrica-pericam-mt. Esta primeira imagem mostra células HeLa viver expressando raciométrica-pericam-mt. A segunda imagem mostra a coloração fluorescente com mitocôndria seletivo corante CMXRos MitoTracker Vermelho. A fluorescência amarelo na imagem fundiu demonstra co-localização de raciométrica-pericam-mt e fluorescência MitoTracker. (B) Uma série de pseudo-relação (495:380 nm) imagens de 4 células HeLa expressar mt-raciométrica pericam tratados com 10 mM ATP . (C) Quantificação das mudanças dos níveis de cálcio mitocondrial na região de interesse (ROI) indicada em (B) tratados com 10 mM ATP. Series (D) de pseudo-relação (495:380 nm) imagens de uma célula HeLa expressar mt -raciométrica pericam tratados com 0,5 mM estaurosporina. Heterogeneidade na resposta de cálcio na mitocôndria indivíduo é evidente, bem como a fragmentação significativa das mitocôndrias por 60 minutos. Alguns têm mitocôndrias aumenta oscilatório em cálcio (cabeça de seta branca), enquanto outros não demonstram alterações significativas no nível de cálcio (cabeça de seta amarela). (E) Quantificação dos aumentos globais nos níveis de cálcio mitocondrial em uma célula HeLa única após a indução de apoptose com 0,5 mM estaurosporina.

Discussion

Aqui apresentamos um método muito simples para a medição de cálcio mitocondrial utilizando-alvo mitocondrial pericam raciométrica. Conforme mostrado na Figura 1A, usando o padrão Widefield óptica sem deconvolução é possível visualizar facilmente mitocôndrias nas células HeLa individuais com relação sinal-ruído aceitável. Isso ocorre porque as células HeLa, como a maioria das células em cultura, achatar significativamente quando aderente evitando a necessidade de microscopia confocal ou outros equipamentos especializados. Temos encontraram resultados semelhantes em células Jurkat adere a poli-lisina lamínulas revestido ^8. Em contraste com metodologias usando corantes, também é possível de forma não invasiva monitorar os níveis de cálcio mitocondrial durante horas utilizando indicadores de cálcio geneticamente codificado como pericam raciométrica (Figura 1E). Isto é especialmente importante quando se analisa o cálcio mitocondrial durante a morte celular. Além disso, também é possível visualizar a cisão / fragmentação da mitocôndria durante o processo de apoptose. Como mostrado nas Figuras 1D e E, o tratamento estaurosporina causa um aumento lento em cálcio em subpopulações seleto de mitocôndrias, que picos em 20 minutos. Níveis de cálcio descer novamente concomitante com a fragmentação mitocondrial antes de subir novamente 2 horas após o tratamento. Isto é consistente com as ondas lentas em cálcio citosólico induzido pelo tratamento estaurosporina medida usando Fura-2 ^9. Assim, as informações cinética importantes podem ser obtidos que não é possível com métodos que empregam medições estáticas. Embora tenhamos apresentado índices e concentrações de cálcio não na Figura 1, é possível calibrar o sensor in situ para calcular os níveis de cálcio absoluta ^{4, 10.} Uma ressalva importante a considerar é que pericam raciométrica é sensível ao pH ^{4, 10.} Como ambos os níveis de pH citosólico e mitocondrial podem mudar dramaticamente durante a apoptose ^11, esta é uma consideração importante. Titulação de pH em pericam mitocôndrias isoladas expressar demonstrar que o aumento da [H ^+] de emissão aumentos de pericam quando animado em 495 nm, com pouco efeito sobre a emissão estimulada pela excitação a 410 nm, uma propriedade que tem sido explorada para medir simultaneamente tanto cálcio mitocondrial e pH ^12. Assim, seletivamente monitoramento de emissões com 410 nm de excitação fornece um meio de não-ratiometrically cálcio mitocondrial acompanhar com preocupação reduzida para pH. Finalmente, o protocolo aqui apresentado requer apenas o acesso a um microscópio de epifluorescência com filtros padrão amplamente disponível, tornando essa técnica acessível para a maioria dos laboratórios.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscópio de imagem de cálcio fluorescente de campo amplo invertido	Nikon Instruments	MEA53310	Qualquer microscópio invertido de campo amplo equipado com filtros de excitação de 380 nm/495 nm e filtro de passagem longa e emissão apropriado pode ser facilmente adaptado para usar este protocolo.
Software de imagem	Molecular Devices	Câmara celular Metafluor
Attofluor	Invitrogen	A-7816	Qualquer câmara de imagem para um microscópio invertido que permita a perfusão seria suficiente.
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	A maioria dos reagentes/protocolos de transfecção seria apropriada para esses estudos
MitoTracker Red CMXRos	Invitrogen	M7512