Contando células-tronco neurais

Summary

Conhecimento do número exato de células viáveis ​​é necessário para muitos manipulações cultura de tecidos. Este protocolo descreve como diferenciar entre células vivas e mortas e quantificar as células usando um hemocitômetro. Embora contando descreve-tronco neurais humanas / precursor células (hNSPCs), ele pode ser usado para outros tipos celulares.

Abstract

Conhecimento do número exato de células viáveis ​​em um determinado volume de uma suspensão de células é necessária para muitas manipulações de rotina de cultura de tecidos, como células de revestimento para imunocitoquímica ou para transfections celular. Este protocolo descreve um método simples e rápido para a diferenciação entre as células vivas e mortas e quantificar a concentração de células eo número total de células usando um hemocitômetro. Este primeiro procedimento requer destacando as células de uma superfície de crescimento e ressuspensão na mídia. Em seguida, as células são diluídas em uma solução de Trypan azul (de preferência a uma concentração que vai dar 20-50 células por quadrante) e colocado no hemocitômetro. Finalmente, a média das contagens de células viáveis ​​em vários quadrantes selecionados aleatoriamente, dividindo a média do volume de um quadrante 1 mm ² (0,1 mL) e multiplicando pelo fator de diluição dá o número de células por l. Multiplicando este concentração celular pelo volume total em mL dá o número total de células. Este protocolo descreve contando-tronco neurais humanas / precursor células (hNSPCs), mas também pode ser usado para muitos outros tipos celulares.

Protocol

Passaging células-tronco neurais

Nota: Consulte o Neural Stem Passaging células artigo sobre como separar e ressuspender as células. https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263

Preparar a suspensão de células de Contagem

1. ML 25 lugar de 0,4% solução azul Trypan e 20 l de mídia celular em um tubo eppendorf.
2. Ressuspender as células a serem contadas batendo o tubo que contém as células em um volume conhecido de mídia para criar uma suspensão homogênea. Colocar 5 mL de células dentro do tubo eppendorf da etapa anterior. Esta etapa dilui a concentração de células por um fator de 10.
3. Coloque a tampa de vidro sobre o hemocitômetro e carregar sobre 11-12 mL da suspensão de células.
   
   
   
   

Contagem de células no hemocitômetro

1. Observar toda a grade do hemocitômetro em um microscópio de contraste de fase. Concentre-se em um quadrante da grade (como a de vermelho).
   
   
   
   
2. Células mortas ou morrendo aparecerá azul por causa de sua membrana foi danificado e não são capazes de excluir o corante azul Trypan. Células viáveis ​​não aparecerá azul e será rodeado por um "halo" de luz em contraste de fase (será "fase brilhante").
3. Contar o número de células viáveis ​​em um quadrante (área 1 mm ^2). Você também pode determinar a viabilidade celular pela divisão do número de células viáveis ​​pelo número total de células. Contagem de células em 04/03 quadrantes aleatórios e determinar o número médio de células por quadrante. Como o volume de um quadrante é conhecido por ser 10 ml ou 0,1 mL ^-4, a concentração de células pode ser determinada
   
   
   
   
   
   
4. Você pode usar o atalho a seguir para determinar as células # / mL:
   
   
   
   Número total de células em tubos = # células / mL X mL em tubo

Discussion

Este protocolo descreve uma maneira simples e rápida para determinar a concentração de células para uma variedade de experiências envolvendo células. Usando o atalho descritas em 3d, pode-se rapidamente e determinar com precisão a concentração de células eo número total de células em um determinado volume.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ferramenta de hemacitômetro de contraste de fase		Hausser Scientific	02-671-54	Distribuído pela Fisher sob o catálogo indicado #
Trypan Blue Stain 0,4%	Reagent	GIBCO, por Life Technologies	15250-061	Distribuído pela Invitrogen sob o catálogo indicado #