Nós introduzimos um conjunto de montagem imunohistoquímica e microscopia confocal de varredura a laser com vários rotulagem para analisar a formação de uma intrincada rede vascular em pele de rato membro embrionárias.
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Artigo de método
Todo-mount Análise imuno-histoquímica para Vascularização embrionárias Limb pele: um sistema modelo para estudar Morfogênese Branching Vascular em Embrião
Neste artigo
Resumo
Resumo
Todo-mount análise imunohistoquímica para a imagem latente toda a vasculatura é fundamental para a compreensão dos mecanismos celulares de ramificação morfogênese. Nós desenvolvemos o membro modelo vascularização da pele para estudar o desenvolvimento vascular em que um pré-existentes primitiva do plexo capilar é reorganizado em uma rede hierarquicamente ramificada vascular. Todo-mount microscopia confocal com rotulagem múltiplos permite imagem robusta dos vasos sanguíneos intacta, assim como seus componentes celulares, incluindo células endoteliais, pericitos e células musculares lisas, usando marcadores fluorescentes específicos. Avanços neste modelo vasculatura membro pele com estudos genéticos têm melhorado a compreensão dos mecanismos moleculares do desenvolvimento vascular e padronização. O membro modelo vasculatura da pele tem sido usada para estudar como os nervos periféricos fornecer um modelo espacial para a diferenciação e padronização das artérias. Este artigo descreve um protocolo de vídeo simples e robusto para corar vasos sanguíneos vascular intacto com anticorpos específicos e fluorescentes anticorpos secundários, que é aplicável para os órgãos vascularizados embrionárias, onde somos capazes de acompanhar o processo de desenvolvimento vascular.
Protocolo
1. Coleta de rato Pele Limb embrionárias (E13.5 E17.5 ~)
- Euthanize conectado fêmeas através de um procedimento aprovado. De acordo com nosso protocolo aprovado animais, as fêmeas são sacrificados por exposição ao CO 2 e, em seguida, assegurada por deslocamento cervical. Lay o animal à sua toalha de papel absorvente e deixe-o completamente em 70% EtOH / H 2 O de uma garrafa squeeze.
- Dissecar o útero intacto e coloque-o em um prato 100 15 mm x Petri contendo solução gelada de Hanks salina balanceada (HBSS) para lavar o sangue.
- Separado e dissecar o embrião. Remover o âmnio muito fina a partir do embrião.
- (O....
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Discussão
O sistema vascular é fundamental para o desenvolvimento do órgão durante a embriogênese, bem como para a manutenção de órgãos e funções reprodutivas nos adultos, pois fornece oxigênio e nutrientes suficientes para os órgãos. Rede vascular adequada é bem estabelecido com processos complexos e multi-passo a angiogênese em que o pré-existentes da rede capilar é reorganizada com estruturas altamente ramificada e hierarquizada. Apesar de inúmeros trabalhos têm demonstrado que uma variedade de moléculas está envolvida nestes .......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Agradecemos a K. Gill para a assistência com a criação do mouse e os cuidados e para a gestão de laboratório. Agradeço também aos membros Mukoyama laboratório para assistência técnica. O financiamento foi fornecido pelo Programa de Pesquisa Intramural dos Institutos de Saúde Naitonal.
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Materiais
Anticorpos
Pan-endotelial marcador de células
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários | |
|---|---|---|---|---|
| Anticorpo | Espécies | Companhia | Catálogo # | Condição de trabalho |
| PECAM-1 | Hamster Armenian (M) | Chemicon | MAB1398Z | Diluição 1:100 # 1 |
| PECAM-1 | Rat (M) | BD | 553369 | 1:300 diluição |
| VEGFR2 | Rat (M) | eBioscience | 14-5821-82 | Diluição de 1:200 |
| CD34 | Rat (M) | eBioscience | 13-0341 | 1:300 diluição |
| Colágeno IV | Coelho (P) | AbD Serotec | 2150-1470 | 1:300 diluição # 2 |
Marcador de células endoteliais arteriais
| Anticorpo | Espécies | Companhia | Catálogo # | Condição de trabalho |
|---|---|---|---|---|
| Neuropilin1 | Coelho (P) | O laboratório Kolodkin Alex # 3 | 1:3000 diluição | |
| Unc5H2 | Bode (P) | R & D | AF1006 | Diluição de 1:200 |
Venosa marcador de células endoteliais
| Anticorpo | Espécies | Companhia | Catálogo # | Condição de trabalho |
|---|---|---|---|---|
| EphB4 | Bode (P) | R & D | AF446 | Diluição 1:100 |
Linfática marcador de células endoteliais
| Anticorpo | Espécies | Companhia | Catálogo # | Condição de trabalho |
|---|---|---|---|---|
| Lyve-1 # 4 | Coelho (P) | Abcam | ab14917 | Diluição de 1:200 |
| Lyve-1 # 4 | Rat (M) | MBL | D225-3 | Diluição de 1:200 |
| Prox-1 | Coelho (P) | Chemicon | AB5475 | 1:1000 diluição |
| Prox-1 | Bode (P) | R & D | AF2727 | 01:50 diluição |
| Neuropilin2 | Coelho (P) | Sinalização celular | 3366 | 1, 100 de diluição |
| Podoplanin | Hamster sírio (M) | Hibridoma Banco | 8.1.1 | Diluição de 1:200 |
Músculo liso marcador de células / pericyte
| Anticorpo | Espécies | Companhia | Catálogo # | Condição de trabalho |
|---|---|---|---|---|
| αSMA-Cy3 | Mouse (M) # 5 | Sigma | c-6198 | 1:500 diluição # 6 |
| NG2 | Coelho (P) | Chemicon | AB5320 | Diluição de 1:200 |
| SM22α | Coelho (P) | Abcam | ab14106 | Diluição de 1:200 |
Anticorpos para repórter GFP
| Anticorpo | Espécies | Companhia | Catálogo # | Condição de trabalho |
|---|---|---|---|---|
| GFP | Coelho (P) | Invitrogen | A11122 | 1:300 diluição |
| GFP | Rat (M) | Nacalai tesque | 04404-84 | 1:1000 diluição |
| GFP | Chick (P) | Chemicon | P42212 | 1:300 diluição |
Anticorpos para repórter LacZ
| Anticorpo | Espécies | Companhia | Catálogo # | Condição de trabalho |
|---|---|---|---|---|
| β-gal | Coelho (P) | MP Biomédica | 55976 | 1:5000 diluição |
| β-gal | Bode (P) | AbD Serotec | 4600-1409 | 1:500 diluição |
| β-gal | Chick (P) | Abcam | ab9361 | Diluição de 1:200 |
Anticorpos para axônio periférico
| Anticorpo | Espécies | Companhia | Catálogo # | Condição de trabalho |
|---|---|---|---|---|
| 2H3 | Mouse (M) # 7 | Hibridoma Banco | 2H3 | Diluição de 1:200 |
| Tuj1 | Mouse (M) # 8 | Covance | MMS-435P | 1:500 diluição |
| Periferina | Coelho (P) | Chemicon | AB1530 | 1:1000 diluição |
Anticorpos para as células de Schwann migrando
| BFABP | Coelho (P) | O laboratório de Thomas Müller # 9 | 1:3000 diluição |
|---|
(P): anticorpo policlonal, (M): anticorpo monoclonal
# 1: Goat anti-armênio hamster-Cy3 anticorpos (Jackson ImmunoResearch 127-165-160) deve ser usado como um anticorpo secundário.
# 2: O Colágeno IV anticorpos podem ser usados para detectar os vasos sanguíneos após a hibridização in situ.
# 3: O anticorpo Neuropilin1 é gentilmente cedidas pelo laboratório do Kolodkin Alex na Johns Hopkins University. Ovelhas anti-anticorpo humano Neuropilin1 está disponível em P & D (AF3870), embora não tenha testado ainda.
# 4: Os anticorpos lyve-1 também detectar um subconjunto de macrófagos na pele embrionárias.
# 5: O anticorpo anti-rato αSMA é anticorpo monoclonal IgG2a.
# 6: O Cy3-conjugados de anticorpos αSMA é incubada por 1 hora à temperatura ambiente, juntamente com secanticorpos secundária para outros anticorpos primários.
# 7: 2H3 anticorpo é rato anticorpo IgG1 monoclonal contra neurofilamento.
# 8: Tuj1 anticorpo é rato de anticorpos monoclonais contra IgG2a Neuron-specific classe III beta-tubulina.
# 9: O BFABP anticorpos (cérebro-específica de ácidos graxos binding protein) é gentilmente cedidas pelo laboratório do Thomas Müller em Max-Delbrück-Center de Medicina Molecular.
Referências
- Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
- Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J.
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Reimpressões e permissões
