Demonstrar os usos do Spectrometer Novel Força Gravitacional para esticar e Medida Proteínas fibrosas

Resumo

Este é um passo-a-passo mostrando o objetivo, funcionamento e resultados representativos do espectrômetro de força gravitacional romance.

Resumo

O estudo da estrutura macromolecular tornou-se crítica para a elucidação dos mecanismos moleculares e função. Existem vários bio-instrumentos limitada, mas importante, capaz de testar a dependência força de características estruturais em proteínas. Escala tem sido um parâmetro limitante sobre a precisão pesquisadores podem perscrutar o mundo nanomechanical de moléculas, tais como ácidos nucléicos, enzimas e proteínas motoras que executam o trabalho de sustentação da vida. Microscopia de força atômica (AFM) é bem afinado para determinar estruturas de proteínas nativas fibroso com uma resolução distância a par com microscopia eletrônica. No entanto, em estudos AFM força, as forças são tipicamente muito maior do que uma única molécula poderá ter ^{1, 2.} Armadilhas ópticas (OT) são muito bons em determinar a distância relativa entre as esferas de presos e que pode dar forças muito pequenas ^3. No entanto, eles não rendem precisa comprimentos absoluta das moléculas em estudo. Simulações moleculares fornecem informações de suporte para tais experiências, mas são limitados na capacidade de lidar com os mesmos grandes tamanhos moleculares, prazos longos, e convencer alguns pesquisadores, na ausência de outras evidências ^{2, 4.}

A força gravitacional espectrómetro (GFS) preenche um nicho importante no arsenal de um investigador, oferecendo uma combinação única de habilidades. Este instrumento é capaz de gerar forças tipicamente com 98% ou maior precisão do intervalo femtonewton à gama nanonewton. As medições de distância atualmente são capazes de resolver o comprimento absoluto molecular até cinco nanômetros, e relativa distâncias par talão de separação com uma precisão semelhante a uma armadilha óptica. Além disso, o GFS pode determinar alongamento ou desenrolando onde a força está perto de equilíbrio, ou fornecer uma força de classificados de justapor contra qualquer medida mudanças estruturais. É ainda possível determinar quantas resíduos de aminoácidos estão envolvidos em eventos desenrolando sob cargas fisiológicas força ^2. Ao contrário de outros métodos onde há força de calibração extenso que deve preceder qualquer ensaio, o GFS não requer calibração tal força ^5. Complementando os pontos fortes de outros métodos, o GFS vai colmatar as lacunas na compreensão do nanomecânica de proteínas vitais e de outras macromoléculas.

Protocolo

Introdução ao GFS Novel Configuração

O GFS consiste de vários componentes essenciais: Um microscópio de luz comum, uma montagem equatorial, uma câmera e um computador [Figura 1]. A câmara de célula de fluxo selada que contém a amostra é também indispensável de acordo com o projeto GFS. O microscópio de luz é montado na montagem equatorial de modo que o escopo pode ser rodado em diferentes orientações no espaço. Esta capacidade permite que o vetor estático de gravidade para ser explorada de modo que as amostras podem ser dinamicamente orientada em relação ao vetor para que a força da gravidade pode transmitir cargas piconewton gama-força par....

Discussão

Ao converter um filme para uma representação digital thresholded, é crucial para a imagem thresholded para manter a mesma área em cada quadro do vídeo. Porque as contas em um par de esferas se movem independentemente um do outro, qualquer desvio nas áreas thresholded também pode causar as distâncias relativas entre os centróides das contas à deriva e introduzir erros significativos. Controlar a área limite reduzido o erro de cinco vezes nas medidas distância de 26 nm até 5 nm. Também é crucial para obter uma medida prec.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
3-aminopropiltrietoxissilano	Polysciences, Inc.	919-30-2
Acetona	Fisher Scientific	A18P-4
Piridina	Sigma-Aldrich	110-86-1
Glutaraldeído	Fisher Scientific	G7776
Glicina	Research Organics	BP381-1
Tris	Sigma-Aldrich	9682T
Azida de sódio	Amresco	71289
BSA	Sigma-Aldrich	AMR-0332-100G
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
EDTA	MSI	E9884
Nitrocelulose	Sigma-Aldrich	60443
N-N Dimetilformamida	Extraído de Grande Novo	D4254
Miosina II esquelética de coelho	Coelhos Nova Zelândia Brancos (7-8)	NA
anticorpo MF30 (9-10)	Banco de Hibridomas para Estudos do Desenvolvimento	MF30
anticorpo MF20 (6)	Banco de Híbridos	MF20
Microscópio de laboratório	Boreal	WW57905M00
Montagem equatorial	Celestron	CG-5
Câmera de vídeo digital	Sony Corporation	XCDV60
Liberação do Caliper	Cabelas	IA-415482
Mola de compressão	Jones Spring Co.	723
Mola de tração	Jones Spring Co.	770
ImageJ	Institutos Nacionais de Saúde	NA
Drivers Fire-i &e aplicação	Unibrain	3.80
Excel	Microsoft	NA