Western Blotting Usando o Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Resumo

Este artigo técnico descreve um procedimento de western-blotting usando o padrão disponível comercialmente NuPAGE sistema de eletroforese Mini-Gel da Invitrogen.

Resumo

Western Blot (ou immunoblotting) é um procedimento padrão de laboratório permitindo que pesquisadores para verificar a expressão de uma proteína, determinar a quantidade relativa das proteínas em diferentes amostras e analisar os resultados da co-imunoprecipitação experimentos. Neste método, uma proteína-alvo é detectado com um anticorpo específico primária em uma dada amostra de homogeneizado de tecido ou extrato. Separação de proteínas de acordo com o peso molecular é obtida através de desnaturação SDS-PAGE. Após a transferência para uma membrana, a proteína-alvo é sondado com um anticorpo primário específico e detectados por quimioluminescência.

Desde sua primeira descrição, a técnica de western-blotting passou por várias melhorias, incluindo a pré-cast géis e user-friendly equipamento. Em nosso laboratório, optou-se por utilizar o sistema de eletroforese comercialmente disponíveis NuPAGE da Invitrogen. É um pH neutro inovadoras, descontínua SDS-PAGE, pré-moldados sistema de mini-gel. Este sistema apresenta várias vantagens sobre a técnica de Laemmli tradicionais, incluindo: i) uma vida útil mais longa dos géis pré-moldados que variam de 8 meses a 1 ano; ii) uma ampla gama de separação pesos moleculares 1-400 kDa, dependendo do tipo de gel utilizados, e iii) maior versatilidade (variação de porcentagem de acrilamida, o tipo de gel, e da composição iônica do tampão de corrida).

O procedimento descrito neste artigo utiliza o vídeo Bis-Tris sistema tampão descontínuo com 4-12% Bis-Tris gradiente géis e MES tampão de corrida, como uma ilustração de como realizar um western blot usando o sistema de eletroforese Invitrogen NuPAGE. Em nosso laboratório, temos obtido bons resultados e reprodutível para várias aplicações bioquímicas usando este método western-blotting.

Protocolo

Eletroforese em gel

Nota técnica: Antes de iniciar o procedimento, têm as suas amostras de proteínas pronto.

Durante esta primeira etapa, as proteínas da amostra são separados de acordo com seu peso molecular por eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante (PAGE). O NuPAGE ® tampão de amostra LDS carregado com dodecilsulfato de lítio (LDS) mantém polipeptídeos em um estado desnaturado uma vez que a amostra de proteína foi aquecida a 70 ° C por 10 minutos. Um forte agente redutor é usado em conjunto para remover estrutura secundária e terciária (DTT, para ....

Discussão

O procedimento sugerido aqui usa um gel Bis-Tris com MES tampão de corrida como um exemplo de desnaturação PAGE utilizando o sistema de eletroforese Invitrogen NuPAGE Novex. Além disso, este sistema de gel pré-cast permite a separação de proteínas sob desnaturação ou não desnaturante condições, bem como acomoda uma ampla gama de pesos moleculares (1-200 kDa para os géis Bis-Tris para 36-400 kDa para o Tris- géis de acetato). Dependendo da sua experiência, você pode optar por seguir apenas uma parte da técnica de western-blotting aqui descri.......