Nós descrevemos um protocolo de observar e analisar as trajetórias de células rolando no assimétrica receptor-padrão substratos. Os dados resultantes são úteis para a engenharia de receptor-padrão substratos para a etiqueta livre de separação de células e análise.
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Artigo de método
Estudando Trajetórias celular Rolamento no Patterns Receptor Asymmetric
Neste artigo
Resumo
Resumo
Deslocamento lateral de células ortogonais a um fluxo fluxo rolando sobre os padrões assimétricos receptor apresenta uma oportunidade para o desenvolvimento de novos dispositivos para a etiqueta livre de separação e análise de células 1. Tais dispositivos podem utilizar deslocamento lateral para separação de fluxo contínuo, ou padrões de receptores que modulam a adesão ao distinguir entre fenótipos celulares diferentes ou níveis de expressão do receptor. Compreensão da natureza das trajetórias de células rolando no receptor-padrão substratos é necessária para a engenharia dos substratos e desenho de tais dispositivos.
Aqui, nós demonstramos um protocolo para o estudo de trajetórias de células rolando sobre os padrões de receptor assimétrica que suporte adesão celular rolando 2. Bem definida, M escala padrões de P-selectina receptores foram fabricados utilizando a impressão em microcontact revestidas de ouro slides que foram incorporados em uma câmara de fluxo. HL60 células que expressam o ligante PSGL-1 3 foram fluiu através de um campo de linhas de estampados e visualizadas em um microscópio de campo invertido brilhante. As células laminadas e monitorados ao longo das bordas inclinadas dos padrões, resultando em um deslocamento lateral. Cada célula tipicamente enrolada por uma certa distância ao longo das bordas padrão (definido como o comprimento de rastreamento borda), individual a partir da borda, e recolocado a um padrão de downstream. Embora essa separação torna difícil acompanhar toda a trajetória de uma célula de entrada até a saída da câmara de fluxo, de partículas de rastreamento de software foi utilizado para analisar e produzir as trajetórias de rolamento das células durante o tempo em que eles estavam se movendo em um único receptor com estampas de linha. As trajetórias foram então analisados para obter distribuições de velocidades de rolamento de células e os comprimentos borda de rastreamento para cada célula de padrões diferentes.
Este protocolo é útil para a quantificação de células trajetórias rolando sobre os padrões de receptor e relacionando estes parâmetros de engenharia para como padrão e ângulo de tensão de cisalhamento. Esses dados serão úteis para o design de dispositivos microfluídicos para a etiqueta livre de separação de células e análise.
Protocolo
1. HL60 célula rolando
1.1. Fabricação de Patterned Substratos.
- Utilizando a impressão microcontact (μCP) 4-7 para fazer alternando monocamadas auto-organizadas (SAMs) de moléculas de PEG nas lâminas de vidro revestidas de ouro: Fabricar microcontact impressão PDMS (polidimetilsiloxano) selos que definiu os padrões de receptor com ângulo de inclinação de α = 10 ° por um SU-8 processo de moldagem. Limpe a superfície de ouro com a solução de piranha (3:1 mistura de ácido sulfúrico a 30% de peróxido de hidrogênio) por 20 minutos e depois enxaguar a superfície com água abundante DI de 24,5 ° C antes do uso. Tinta do carimbo....
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Discussão
Nós descrevemos um protocolo para examinar células trajetórias rolando no assimétrica receptor-padrão superfícies fabricados utilizando a impressão microcontact 2. As imagens do microscópio óptico da superfície modelada mostrando claro contraste entre PEG e P-selectina áreas podem ser usados para confirmar se a impressão é bem sucedida. Sharp, bordas retas pode ser observado quando a estampagem é feita assim. Duro pressionando do selo pode resultar em deformação do selo que limita a precisão dos padrões. Bo.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este projecto foi apoiado pelo Centro Deshpande para a Inovação Tecnológica no MIT (RK e JMK) ea concessão de CARREIRA NSF 0952493 para RK através do programa de Química e Biológica Separações. Agradecemos ao Instituto de Nanotecnologias Soldier (ISN) ea Microsystems Technology Laboratory (MTL) no MIT para utilização de suas instalações.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Células de leucemia promielocítica humana | ATCC | CCL-240 | Células HL60 |
| Lâminas de vidro revestidas com ouro | EMF | TA134 | Lâminas de ouro |
| (1-Mercaptoundec-11-yl)tetra(ethylene glycol) | Sigma-Aldrich | 674508 | PEG |
| P-selectina humana recombinante | R&D Systems | ADP3-050 | P-selectina |
| Albumina sérica bovina | Rockland Immunochemicals | BSA-50 | BSA |
| Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco’s | Mediatech, Inc. | 21-030 | DPBS |
| Ácido sulfúrico | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| Peróxido de hidrogênio | Sigma-Aldrich | 316989 |
Referências
- Karnik, R., Hong, S., Zhang, H., Mei, Y., Anderson, D. G., Karp, J. M., Langer, R. Nanomechanical control of cell rolling in two dimensions through surface Patterning of receptors. Nano Lett. 8 (4), 1153-1158 (2008).
- Lee, C. H., Bose, S., Van Vliet, K. J., Karp, J. M., Karnik, R.
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Reimpressões e permissões
