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Definir a distribuição subcelular de complexos de sinalização é imprescindível para a compreensão de que a saída do complexo. Métodos convencionais, tais como imunoprecipitação não fornecem informações sobre a localização espacial dos complexos. Em contraste, BiFC monitora a interação e compartimentalização subcelular de complexos de proteínas. Neste método, uma proteína fluororescent é dividido em amino-e carboxi-terminal não-fluorescentes fragmentos que são então fundidas para duas proteínas de interesse. Interação das proteínas resulta na reconstituição do fluoróforo (Figura 1) 1,2. Uma limitação do BiFC é que uma vez que o fluoróforo fragmentada é reconstituído o complexo é irreversível 3. Esta limitação é vantajoso na detecção de interações transitória ou fraco, mas impede uma análise cinética da dinâmica complexa. Uma advertência adicional é que o flourophore reconstituído requer 30min para amadurecer e fluorescentes, mais uma vez impedindo a observação de interações em tempo real 4. BiFC é um exemplo específico do ensaio complementação protéica fragmento (APC), que emprega proteínas repórter como o verde variantes proteína fluorescente (BiFC), diidrofolato redutase, b-lactamase, e luciferase para medir proteína: interações de proteínas 5,6. Métodos alternativos para o estudo de proteínas: as interações das proteínas nas células incluem fluorescência co-localização e transferência de energia de ressonância Förster (FRET) 7. Para co-localização, duas proteínas são individualmente marcados diretamente com um fluoróforo ou por imunofluorescência indireta. No entanto, esta abordagem leva a fundo elevado de proteínas não-interativas que torna difícil de interpretar co-localização de dados. Além disso, devido aos limites de resolução da microscopia confocal, duas proteínas podem aparecer co-localizadas, sem necessariamente interagir. Com BiFC, a fluorescência é observada somente quando as duas proteínas de interesse interagem. FRET é outro método excelente para estudar proteínas: interações de proteínas, mas pode ser tecnicamente desafiadora. FRET experimentos requerem o doador e receptor seja de brilho semelhantes e estequiometria na célula. Além disso, deve-se conta de sangrar através do doador para o canal receptor e vice-versa. Ao contrário FRET, BiFC tem pouco fundo de fluorescência, o pós-processamento de dados de imagem pouco, não exige a superexpressão de alta, e pode detectar interações fracas ou transitórios. Bioluminescência transferência de energia de ressonância (BRET) é um método semelhante ao FRET exceto o doador é uma enzima (luciferase, por exemplo) que catalisa um substrato para se tornar bioluminescente, assim, uma emocionante aceitador. BRET falta a problemas técnicos de sangrar através fluorescência de fundo e alta, mas não tem a capacidade de fornecer informação espacial, devido à falta de localização do substrato para compartimentos específicos 8. No geral, BiFC é um excelente método para a visualização de localização subcelular de complexos de proteínas para obter insights sobre sinalização compartimentada.