A técnica é descrita para quantificar a resposta fisiológica em vivo dos neurônios de mamíferos durante o movimento e correlacionar a fisiologia do neurônio com a morfologia neuronal, fenótipo neuroquímico e microcircuitos sináptica.
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Artigo de método
Caracterização fisiológica, morfológica e neuroquímicos de Neurônios Modulada por Movimento
Neste artigo
Resumo
Resumo
O papel dos neurônios individuais e sua função nos circuitos neuronais é fundamental para a compreensão dos mecanismos neuronais das funções sensoriais e motoras. A maioria das investigações de mecanismos sensório-motor dependem, quer o exame de neurônios ao mesmo tempo um animal é 1,2 estática ou atividade neuronal registro extracelular durante um movimento. 3,4 Embora esses estudos forneceram a base fundamental para a função sensório-motor, que não quer avaliar as informações funcionais que ocorre durante um movimento ou estão limitados na sua capacidade de caracterizar plenamente o fenótipo anatomia, fisiologia e neuroquímica do neurônio. A técnica é mostrada aqui, que permite a caracterização extensa de neurônios individuais durante um em movimento vivo. Esta técnica pode ser usada não só para estudar neurônios aferentes primários, mas também para caracterizar os motoneurônios e interneurônios sensório-motor. Inicialmente, a resposta de um único neurônio é gravado usando métodos eletrofisiológicos durante vários movimentos da mandíbula seguido por determinação do campo receptivo para o neurônio. Um traçador neuronal é, então, intracelularmente injetado no neurônio e do cérebro é processada de modo que o neurônio pode ser visualizado com microscopia de luz, elétron ou confocal (Fig. 1). A morfologia detalhada do neurônio é caracterizado depois reconstruída de modo que a morfologia neuronal pode ser correlacionada com a resposta fisiológica do neurônio (Figs. 2,3). Nesta comunicação detalhes importantes e dicas importantes para a implementação bem sucedida dessa técnica são fornecidos. Informações adicionais valiosas pode ser determinada para o neurônio em estudo através da combinação deste método com outras técnicas. Rotulagem neuronal retrógrada pode ser utilizada para determinar os neurônios com que as sinapses dos neurônios rotuladas, permitindo assim a determinação detalhada dos circuitos neuronais. Imunocitoquímica pode ser combinado com este método para examinar neurotransmissores no neurônio rotulados e para determinar os fenótipos químicos de neurônios com que as sinapses dos neurônios marcados. O neurônio marcado também podem ser processados para microscopia eletrônica para determinar as características ultra-estruturais e micro circuitos do neurônio rotulados. Geral esta técnica é um método poderoso para caracterizar completamente os neurônios durante em movimento vivo, permitindo assim uma visão substancial sobre o papel do neurônio em função sensório-motor.
Protocolo
1. Preparação dos animais
- Anestesiar ratos com pentobarbital sódico (50mg/kg IP) e coloque sobre uma almofada de aquecimento. Raspar a pele que recobre o crânio posterior com clippers animal. Verifique o animal para assegurar que um nível cirúrgica do nível de anestesia foi obtida por meio de testes para a ausência de um reflexo de retirada e vocalização quando os dedos são comprimidos, bem como a ausência de reflexo palpebral. Verificar o nível de anestesia a cada 15 minutos e manter um nível cirúrgico de anesthetisa por injeções de pentobarbital sódico 15mg/kg a cada 45 minutos.
- Use uma técnica asséptica e fazer uma incisão na região inguinal i....
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Discussão
O método ilustrado aqui é uma poderosa técnica que fornece informação importante sobre a função dos neurônios individuais e como a resposta de neurônios individuais contribui para circuitos neuronais. 9 Este conhecimento é fundamental para a compreensão da função sensório-motor. A maior força desta técnica é que permite a determinação é de um grande número de parâmetros sobre um neurônio, incluindo a fisiologia, a morfologia ea morfologia e distribuição sináptica. Quando combinado com outras técnicas, como in.......
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Divulgações
Experimentos em animais foram realizados de acordo com o guidlines e regulação estabelecidas no Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (NIH Publication No. 86-23, revisado em 1985) e da Universidade de Maryland Animal Care e Use Comitê.
Agradecimentos
Agradeço Anthony Taylor para a formação inicial em gravação no intracelular vivo e A Maxwell e David Brown para ajudar com o desenvolvimento inicial da técnica de coloração intracelular. Agradeço M. Prata ajuda com a macro collocalization. Muitos estudiosos com quem tenho colaborado desde insight para o desenvolvimento desta técnica, incluindo R. Donga, Moritani M., P. Luo, Ambalavanar R.. Esta técnica foi desenvolvida com o apoio considerável de NIH concede DE10132, DE15386 e RR017971.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente ou equipamento | Companhia | Número de catálogo | Comentários |
| vibrador eletromagnético | Ling Dynamic Systems | V101 | |
| gerador de sinal | Sistemas de Medição | PFG605 | capaz de produzir o sinal de saída trapezoidal |
| eletrodo de vidro | Sutter Instruments | AF100-68-10 | com filamento |
| extrator eletrodo | Sutter Instruments | Modelo P-2000 ou P-80 | |
| biotinamide | Vector Laboratories | SP-1120 | armazenados a 4 ° C |
| Texas Red avidina DCS | Vector Laboratories | A-2016 | |
| tetramethlyrhodamine | Sondas moleculares | D-3308 | 3000 o peso molecular, lisina fixable |
| rato de anticorpos anti-sinaptofisina | Chemicon | MAB5258 | |
| fluorescentes mancha Nissl | Neurotrace, Molecular Probes | N-21480 | |
| testador de eletrodo | Winston Eletrônica | BL-1000-B | para medir a impedância do eletrodo |
| eletrômetro | Axon Instruments | Axoprobe 1A, 2B Axoclamp |
Referências
- Cuellar, C. A., Tapia, J. A., Juarez, V., Quevedo, J., Linares, P., Marinez, L., Manjarrez, E. Propagation of sinusoidal electrical waves along the spinal cord during a fictive motor task. J. Neurosci. 29, 798-810 (2010).
- Frigon, A., Gossard, J.
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Reimpressões e permissões
