Imunocitoquímica é um poderoso método para determinar a presença, localização subcelular e abundância relativa de um antígeno de interesse em células em cultura. Este protocolo apresenta um fácil de seguir série de medidas que permitirão uma anticorpos para conservar e tirar o máximo proveito da própria coloração.
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Artigo de método
Imunocitoquímica: células-tronco neurais
Neste artigo
Resumo
Resumo
Imunocitoquímica é um método muito poderoso e bastante simples para determinar a presença, localização subcelular e abundância relativa de um antígeno de interesse, geralmente uma proteína, em células em cultura. Este protocolo apresenta um fácil de seguir série de passos que vai permitir aos investigadores para conservar anticorpos primário e secundário ao obter alta qualidade, reprodutíveis e qualitativa de dados quantitativos de sua coloração. Há dois aspectos deste protocolo, que contribuirá para a conservação do volume de anticorpos necessário para a coloração. Por um lado, as células são cultivadas em pequenas, lamínulas circulares que são colocados em poços de uma placa de cultura de tecidos. Após a fixação, as células em lamínulas podem ser removidos dos poços da placa. Para a coloração de anticorpos, as lamelas com células é invertido em uma pequena gota de solução anticorpo em parafilme e é coberta com um segundo pedaço de parafilme para evitar a secagem. Usando este método, apenas ~ 25 ml de solução de anticorpo é necessária para cada lamela (ou amostra) a ser manchada. Este protocolo descreve imunocoloração de-tronco neurais humanas / precursor células (hNSPCs), mas pode ser usado para muitos outros tipos celulares.
Protocolo
Dia 1: Células Preparando Lamelas de vidro alemão e Seeding
Nota: lamínulas alemães são muitas vezes preferível para cultura primária de células-tronco neurais e neurônios. Nós usamos o protocolo de limpeza a seguir para melhorar a adesão celular e se espalhando. Lamínulas posição em um rack pequeno que permitirá o acesso líquido para ambos os lados da lamela. Primeiro, lamínulas incubar em Liquinox 1% por 10 minutos, seguido de 3 lavagens com água deionizada. Certifique-se que não permaneçam bolhas de sabão. Em seguida, desliza incubar em 1M HCl por 30 minutos, seguido de 3 lavagens com água deionizada. Lamínulas seco a 65 ° C dur....
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Discussão
Este protocolo descreve um procedimento de imunomarcação para hNSPCs que minimiza o volume de anticorpos necessário e dá coloração celular confiável. O procedimento descrito é o melhor para os antígenos intracelulares, mas podem ser modificados para mancha moléculas de superfície celular ou para melhorar a coloração do citoesqueleto.
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Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer o Dr. Philip H. Schwartz da Célula de Recursos Humanos Neural Stem Nacional no Hospital da Criança, Orange County Instituto de Pesquisa para a prestação de culturas hNSPC e Dr. Gary Bassell da Universidade de Emory para a instrução inicial na técnica de coloração parafilme.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários | |
|---|---|---|---|---|
| Lâminas de vidro alemã (Deutsche Spiegelglas) | Ferramenta | Carolina Biological | WW-63-3029 | Lâminas de 12, 15, 18, 22 e 25 mm disponíveis |
| Detergente livre de fosfato Liquinox | Reagente | Sigma-Aldrich | Z273279 | muito viscoso |
| Poli-D-lisina hidrobrometo | Reagente | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Laminina, natural de camundongo | Reagente | Invitrogen | 23017-015 | |
| EMEM (1X) | Reagente | Mediatech, Inc. | MT-10-010-CV | Distribuído pela Fisher com o número de catálogo indicado |
| Placa de 24 poços | Ferramenta | Fisher Scientific | 08-772-1 | |
| Triton X-100 | Reagente | Fisher Scientific | BP151-500 | muito viscoso |
| Paraformaldeído | Reagente | Sigma-Aldrich | P6148 | potencial carcinógeno, use cautela ao manipulá-lo na forma de pó e solução |
| Albumina sérica bovina, livre de IgG | Reagente | Jackson ImmunoResearch | 001-000-161 | |
| H–chst 33342 | Reagente | Invitrogen | H-1399 | |
| Vectashield | Reagente | Vector Laboratories | H-1000 | viscoso |
Referências
- Flanagan, L. A., Chou, J., Falet, H., Neujahr, R., Hartwig, J. H., Stossel, T. P., Filamin, A. Filamin A, the Arp2/3 complex, and the morphology and function of cortical actin filaments in human melanoma cells. J. Cell Biol. 155, 511-518 (2001).
- Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S.
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Reimpressões e permissões
