Imunocitoquímica: células-tronco neurais

Resumo

Imunocitoquímica é um poderoso método para determinar a presença, localização subcelular e abundância relativa de um antígeno de interesse em células em cultura. Este protocolo apresenta um fácil de seguir série de medidas que permitirão uma anticorpos para conservar e tirar o máximo proveito da própria coloração.

Resumo

Imunocitoquímica é um método muito poderoso e bastante simples para determinar a presença, localização subcelular e abundância relativa de um antígeno de interesse, geralmente uma proteína, em células em cultura. Este protocolo apresenta um fácil de seguir série de passos que vai permitir aos investigadores para conservar anticorpos primário e secundário ao obter alta qualidade, reprodutíveis e qualitativa de dados quantitativos de sua coloração. Há dois aspectos deste protocolo, que contribuirá para a conservação do volume de anticorpos necessário para a coloração. Por um lado, as células são cultivadas em pequenas, lamínulas circulares que são colocados em poços de uma placa de cultura de tecidos. Após a fixação, as células em lamínulas podem ser removidos dos poços da placa. Para a coloração de anticorpos, as lamelas com células é invertido em uma pequena gota de solução anticorpo em parafilme e é coberta com um segundo pedaço de parafilme para evitar a secagem. Usando este método, apenas ~ 25 ml de solução de anticorpo é necessária para cada lamela (ou amostra) a ser manchada. Este protocolo descreve imunocoloração de-tronco neurais humanas / precursor células (hNSPCs), mas pode ser usado para muitos outros tipos celulares.

Protocolo

Dia 1: Células Preparando Lamelas de vidro alemão e Seeding

Nota: lamínulas alemães são muitas vezes preferível para cultura primária de células-tronco neurais e neurônios. Nós usamos o protocolo de limpeza a seguir para melhorar a adesão celular e se espalhando. Lamínulas posição em um rack pequeno que permitirá o acesso líquido para ambos os lados da lamela. Primeiro, lamínulas incubar em Liquinox 1% por 10 minutos, seguido de 3 lavagens com água deionizada. Certifique-se que não permaneçam bolhas de sabão. Em seguida, desliza incubar em 1M HCl por 30 minutos, seguido de 3 lavagens com água deionizada. Lamínulas seco a 65 ° C durante a noite. Transferência de lamínulas para um prato de vidro e autoclave para esterilizar.

1. Em uma capa de cultura de tecidos, coloque lamínulas estéreis em uma placa de tamanho apropriado bem.
   
   
2. Lamínulas casaco com laminina para adesão celular. Lamínulas incubar em 10 mcg / ml poli D-lisina (PDL) em água estéril por 5 minutos em temperatura ambiente. Remover lamínulas PDL e incubar em 20 mcg / ml laminina na EMEM por 4 horas, ou durante a noite, em um 37 ° C de cultura de tecidos incubadora.
   
   
   
   1. Nota: Consulte o artigo Neural Stem Passaging Humanos Cells ( https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 ) ea Human Neural Stem Contando artigo Cells ( https://www.jove.com / index / Details.stp? ID = 262 ) para aprender a ressuspender e contar hNSPCs.
      
      
3. Enxágüe laminina revestido lamínulas com PBS e as células de semente em cada lamela contendo bem em uma certa densidade (muitas vezes usamos uma densidade inicial de chapeamento 100,000-300,000 células / ml para as células que estamos revestimento para a imunocoloração).
   
   
4. Colocar a placa em 37 ° C a cultura de tecidos incubadora e permitem que as células a aderir em lamínulas (geralmente um mínimo de 4 horas é necessário).

Dia 2: Fixação permeabilização, bloqueio, e adição de anticorpo primário para Células

Nota: Usamos o fixador paraformaldeído seguintes 4% para preservar a morfologia das células. A receita inclui uma transição pH para permitir que o paraformaldeído para entrar em solução. Nós preferimos este método ao invés do uso de calor para dissolver paraformaldeído porque as temperaturas mais altas podem levar à geração de ácido fórmico, que pode aumentar coloração de fundo quando se utiliza de fluorescência. Alguns componentes do fixador ajudar a preservar a estrutura do citoesqueleto (MgCl ₂ e EGTA), enquanto outros ajudam a manter a morfologia geral (sacarose).

Fixadora paraformaldeído 4% para Células

Reagentes e passos:	Montante para 100 mL de fixador:
Água MilliQ	75 ml
Paraformaldeído (pesar na capela)	4 g
NaOH 10N, mexa e adicione algumas gotas até que a solução limpa	quando necessário
PBS 10X	10 ml
1M MgCl 2	0,5 ml
0,5 M EGTA	2 ml
Sacarose	4 g
6N HCl, titular de pH 7,4	quando necessário
Água MilliQ	trazer para 100 ml
Armazenar a 4 ° C por até 1 semana. Quente a 37 ° C antes do uso

1. No banco, remova a mídia e adicione fixador pré-aquecido. Incubar por 5-15 minutos (dependendo do antígeno a ser detectado, normalmente os usamos 10 minutos). Realizar esta e as etapas a seguir à temperatura ambiente.
   
   
2. Descartar o fixador para um recipiente adequado, como muitas instituições lidar com paraformaldeído como resíduos perigosos. Lave as células 3 vezes com PBS, 5 minutos de cada vez. Ao remover soluções a partir de células, tenha cuidado que a sucção não seque as células. Além disso, sempre tem a próxima solução na mão para adicionar células antes de remover a solução que reveste-los para as células não são deixados para secar.
   
   
3. Se o antígeno de interesse é no interior da célula, a membrana celular deve ser feita permeável para permitir a entrada do anticorpo. Para permeabilizar as células, use uma nova solução de 0,3% Triton X-100 em PBS. Pipeta lentamente porque Triton é viscoso, e certifique-se o detergente é completamente dissolvido em PBS antes de adicionar às células. Permeabilizar as células por 5 minutos, seguido de lavagem das células 3 vezes com PBS, 5 minutos de cada vez.
   
   
4. As células devem ser tratados com um agente de bloqueio para evitar ligações não específicas do anticorpo. Usamos albumina bovina (BSA) como um agente de bloqueio. A solução de bloqueio é feito através da dissolução BSA 5% em PBS (em um balancim ou rotador, porque leva tempo para dissolver), em seguida, filtrar o solution com um filtro de seringa de 0,45 mM. Bloco de células em 5% solução BSA / PBS por 1 hora à temperatura ambiente.

Diluir o anticorpo primário (que é quase específico para a proteína de interesse) a uma concentração pré-determinada em 1% BSA / PBS (preparadas por diluição de 5% BSA / PBS). Coloque o anticorpo primário diluído (30 mL por 25 lamela mm, 20 l por 18 lamela mm, 15 mL por 12 lamela mm) em uma placa de vidro coberta com parafilme. Pick up a lamela com células fixas, inverter de tal forma que as células viradas para baixo, e coloque-o sobre a solução de anticorpos para que as células estão em contato com o anticorpo. Coloque uma tira parafilme segundo sobre a construção inteira. Incubar a 4 ° C durante a noite.

Dia 3: lavar roupa, incubação com anticorpo secundário, Stain Nuclear e de montagem

1. Remova cuidadosamente a fita parafilme topo e pegar as lamelas, invertê-lo, e colocá-lo de volta para a placa com PBS em cada poço de lava de modo que as células são virados para cima.
   
   
2. Lave as células 3 vezes com PBS, 5 minutos de cada vez.
   
   
3. Escolha um anticorpo secundário que irá detectar o anticorpo primário, por exemplo, se o anticorpo primário foi feito em um coelho, o anticorpo secundário devem reconhecer coelho IgG. Tome cuidado também para coincidir com o isotipo de anticorpos (IgG, IgM, etc). Se estiver usando múltiplos anticorpos primários, certifique-se que eles são de diferentes espécies ou isotipos, e plano para detectar com diferentes marcadores ligados aos anticorpos secundários. Por exemplo, você poderia usar um anti-coelho acoplado secundária a um fluoróforo vermelho com um mouse acoplado anti secundária a um fluoróforo verde. Incubar as células na solução de anticorpo secundário diluído para uma concentração adequada em BSA 1% por 2 horas no escuro a temperatura ambiente, usando a mesma técnica para a primária (passos não mostrado no vídeo). O volume de anticorpo secundário necessário para a incubação pode ser ligeiramente maior do que aquele para o anticorpo primário, se o secundário é armazenado como uma solução de glicerol (40 mL por 25 lamela mm, 30 mL por 18 lamela mm, 25 mL por 12 lamela mm) .
   
   
   • Nota: Se você estiver usando moléculas fluorescentes para visualizar o anticorpo secundário, a amostra precisa ser protegido da luz uma vez que o anticorpo secundário foi adicionado. Incubar no escuro, ou em uma placa de alumínio coberta.
     
     
4. Remova cuidadosamente as lamelas das parafilme como descrito para o anticorpo primário. Lave as células duas vezes com PBS, 5 minutos cada tempo, seguido por um 1 minuto de incubação de 2 mg / ml nuclear Hoechst mancha diluído em PBS (se um contracorante nuclear é o preferido). Se a mancha é antiga Hoechst eo sinal é muito fraca, você pode aumentar o tempo de incubação e / ou a concentração. Após a incubação com Hoechst, lave uma vez com PBS por 5 minutos.
   
   
5. As lamelas deve ser montado em um slide com meios de montagem para a visualização em um microscópio. Nos casos em que uma molécula fluorescente é utilizado para visualização do anticorpo secundário, a meios de montagem deve conter agentes para minimizar fotobranqueamento. Usamos Vectashield como uma mídia de montagem para fluorescência. Coloque uma gota de tamanho adequado Vectashield numa lâmina de microscópio (12 mL por 25 lamela mm, 6 mL por 18 lamela mm, 3 mL por 12 lamela mm).
   
   
6. Com cuidado, pegue a lamínula e lavar as costas com água deionizada para remover os sais (a partir da PBS). Dab o excesso de água em um kimwipe ou toalha de papel, e se lançou a gota de Vectashield com células virada para baixo. Coloque a lamínula sobre em um ângulo e permitir a descer lentamente para evitar bolhas de retenção de ar. Rótulo o slide com a data e as informações da amostra.
   
   
7. Permitir slides com lamínulas para secar (no escuro) de sucção, em seguida, o excesso de off Vectashield em torno da borda da lamínula. As bordas da lamínula agora pode ser selada com unha polonês, se desejar (especialmente útil se lamínulas serão visualizadas em um microscópio invertido). Costumamos salvar nossos slides em um freezer -20 C °.

Discussão

Este protocolo descreve um procedimento de imunomarcação para hNSPCs que minimiza o volume de anticorpos necessário e dá coloração celular confiável. O procedimento descrito é o melhor para os antígenos intracelulares, mas podem ser modificados para mancha moléculas de superfície celular ou para melhorar a coloração do citoesqueleto.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Lamínulas de vidro alemão (Deutsche Spiegelglas)	Ferramenta	Carolina Biological	WW-63-3029	12,15,18, 22, 25 mm lamínulas disponíveis
Detergente sem fosfato Liquinox	Reagente	Sigma-Aldrich	Z273279
bromidrato de poli-D-lisina	Reagente	Sigma-Aldrich	P7280
Laminina, reagente natural de camundongo		Invitrogen	23017-015
EMEM (1X)	Reagente	Mediatech, Inc.	MT-10-010-CV	Distribuído pela Fisher sob o catálogo indicado #
24 placa de poço	Ferramenta	Fisher Scientific	08-772-1
Triton X-100	Reagente	Fisher Scientific	BP151-500	viscoso
Paraformaldeído	Reagente	Sigma-Aldrich	P6148	potencial cancerígeno, tenha cuidado ao usá-lo em pó
e soluçãoAlbumina de Soro Bovino, Reagente Livre de IgG		Jackson ImmunoResearch	001-000-161
H– chst 33342	Reagente	Invitrogen	H-1399
Vectashield	Reagente	Vector Laboratories	H-1000	viscoso