Nós descrevemos um protocolo para a microfabricação do dispositivo de geração de gradiente microfluídicos que pode gerar gradientes espaciais e temporais bem definidos em microambiente. Nesta abordagem, o dispositivo de geração de gradiente microfluídicos pode ser usado para estudar a migração celular dirigido, a embriogênese, cicatrização de feridas, e metástase de câncer.
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Artigo de método
Um dispositivo de geração de Gradient microfluídicos de Biologia Celular
Neste artigo
Resumo
Resumo
A fabricação e operação de um dispositivo de geração de gradiente microfluídicos para estudar o comportamento celular é descrito. Uma plataforma microfluídica é uma ferramenta que permite experimental, precisamente porque pode manipular fluxos de líquidos, permitem alto rendimento experiências, e gerar gradientes de concentração estável solúvel. Comparado com os geradores gradiente convencional, poli (dimetilsiloxano) (PDMS) com base em dispositivos microfluídicos pode gerar gradientes de concentração de fatores de crescimento estável, com perfis bem definidos. Aqui, nós desenvolvemos simples gradiente de geração de dispositivos microfluídicos com três entradas distintas. Três microcanais combinados em um microcanal de gerar gradientes de concentração. A estabilidade ea forma de gradientes de fator de crescimento foram confirmados por fluoresceína isothyiocyanate (FITC)-dextran com peso molecular semelhante ao fator de crescimento epidérmico (EGF). Usando este dispositivo micro, foi demonstrado que fibroblastos expostos a gradientes de concentração de EGF migraram para concentrações mais elevadas. A orientação direcional de migração celular e motilidade das células migrando foram quantitativamente avaliados por análise de células de rastreamento. Assim, este dispositivo de geração de gradiente microfluídicos pode ser útil para estudar e analisar o comportamento das células migratórias.
Protocolo
A. Microfabricação do dispositivo de geração de gradiente microfluídicos
- O wafer Si é tratada com plasma de oxigênio reativo (5 min de 30W, Harrick Científico, NY).
- Fotorresiste negativo (SU-8 50, Microchem, MA) é spin-revestido a 1000 rpm por 1 min em um wafer de silício.
- O wafer é mole cozido a 65 ° C por 10 min e, posteriormente, a 95 ° C por 30 min em uma placa.
- O wafer é exposto à luz UV (200W) por 3 minutos através de uma máscara de transparência com uma dimensão mínima de 30 mm.
- O wafer é pós cozido a 65 ° C por 1 min e em 95 ° C por 10 min.
- Si molde mestre com 100 canais mm de espessura é desenvolvi....
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Discussão
Células expostas a gradientes de concentração estável de EGF em um dispositivo micro migraram para concentrações mais elevadas. A orientação direcional de migração celular, índice quimiotático, motilidade das células migrando foram investigadas pela análise de células de rastreamento. Portanto, esta plataforma de geração de gradiente microfluídicos poderia ser útil para estudar metástase de câncer, a embriogênese, e orientação axônio.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários | |
|---|---|---|---|---|
| Dextran-FITC | Reagente | Sigma-Aldrich | FD10S | Dextrana conjugada com isotiocianato de fluoresceína (FITC) (10 kD) |
| hr-EGF | Invitrogen | 13247-051 | Fator de crescimento epidérmico recombinante humano | |
| PDMS | K.R. Anderson Co. | 2065622 | Polímero de (dimetilsiloxano) (PDMS), Dow Corning Sylgard 184 (8,6 lb) | |
| Fotolito negativo | MicroChem Corp. | SU-8 50 | ||
| Wafer de silício | Wafer de silício, 4 polegadas | |||
| Placas de Petri | ||||
| Tubo de polietileno | BD Biosciences | PE 20 | ||
| PBS | Invitrogen | |||
| Fibronectina | ||||
| NIH 3T3 | linha celular | células fibroblásticas | ||
| Microscópio invertido | Nikon Instruments | TE 2000 |
Referências
- Jeon, N. L., Baskaran, H., Dertinger, S. K. W., Whitesides, G. M., Van de Water, L., Toner, M. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotechnol. 20, 826-830 (2002).
- Lin, F., Nguyen, C. M., Wang, S. J., Saadi, W., Gross, S. P., Jeon, N. L.
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Reimpressões e permissões
