Summary
In newt, de lens regenereert altijd vanaf het dorsale iris door transdifferentiatie van de iris gepigmenteerde epitheelcellen (IPE). Hier beschrijven we een procedure om cultuur dorsale en ventrale newt IPE cellen en hun inplanting op de newt oog. De geïmplanteerde cellen worden vervolgens onderzocht door weefsel snijden en immunohistochemie.
Abstract
Salamanders, zoals newt en axolotl beschikken over de mogelijkheid om veel van haar verloren lichaamsdelen, zoals ledematen, de staart met ruggenmerg, ogen, hersenen, hart, de kaak een regenereren. In het bijzonder, salamanders uniek zijn voor de lens regeneratie vermogen. Bij de lens verwijderd, IPE cellen van de dorsale iris transdifferentiate om de lens cellen en uiteindelijk een nieuwe lens formulier in ongeveer een maand 2,3. Deze eigenschap van regeneratie wordt nooit getoond door het ventrale iris cellen. De regeneratie vermogen van de iris-cellen kan worden bestudeerd door het maken van transplantatie van de in vitro gekweekte cellen IPE. Voor de cultuur, de dorsale en ventrale iris cellen eerst geïsoleerd uit het oog en apart gekweekt voor een periode van 2 weken (figuur 1). Deze gekweekte cellen zijn reaggregated en terug geïmplanteerd naar de newt oog. Eerdere onderzoeken hebben aangetoond dat het dorsale reaggregate de lens vormen van capaciteit behoudt terwijl de ventrale aggregaat vormt geen lens met vermelding van, dus de in vivo proces (figuur 2) 4,5. Dit systeem van het bepalen van de regeneratie mogelijkheden van dorsale en ventrale iris cellen is zeer nuttig in het bestuderen van de rol van genen en eiwitten betrokken bij lens regeneratie.
Protocol
1. Iris Cel Cultuur
- Verzamel oogballen van 7 salamanders (verdoofd in 0,1% ethyl-3-aminobenzoaat methaan sulfonzuur bereid in PBS) en plaats in calcium magnesium vrij Hanks-oplossing (CMF).
- Verandering handschoenen en werk in de weefselkweek kap.
- Steriliseer het oog ballen in Lugol's-EtOH gedurende 3 seconden.
- Was twee keer in CMF.
- Overdracht ogen om te Hanks en begint dissectie.
- Ontleden iris-hoornvlies complex en te verwijderen neurale netvlies.
- Transfer complexen in een nieuwe schotel van Hanks.
- Met behulp van # 15 scalpel, een aparte complexen in dorsale en ventrale helften.
- Verwijder de iris fragmenten (ventrale eerste) en doe dit in een schotel met 1 ml L-15.
- Voeg 15% (150 ul) volume van dispase (7,5 eenheden / ml concentratie).
- Incubeer bij 27 ° C gedurende 2 uur (wrap schotel met parafilm).
- Isoleer IPE cellen van stroma (Plaats trypsine oplossing bij 27 ° C).
- Verzamel IPE cellen in een 1.5 ml buis.
- Centrifugeer bij 1000 tpm bij RT (kamertemperatuur) voor 2 minuten, verwijder supernatant.
- Wassen met 1 ml Hanks en centrifugeer bij 1000 tpm bij RT gedurende 2 minuten, verwijder supernatant.
- Voeg 1 ml trypsine oplossing; incubeer gedurende 2 uur bij 27 ° C.
- Centrifugeer bij 1000 tpm bij RT gedurende 2 minuten, verwijder trypsine.
- Voeg 1 ml L-15 te wassen, bij 1000 rpm gedurende 2 minuten centrifugeren.
- Voeg 800 ul L-15, pipet langzaam op en neer ~ 10 keer (meer dan 12 keer minder therapietrouw).
- Het bord van de IPE cellen op een 24 goed collageen gecoate plaat en incubeer bij 27 ° C gedurende 2 weken (meestal vier dorsale en ventrale vier putten verkregen uit zeven salamanders).
- In dit stadium cellen zijn geschikt voor gen transfectie of behandeling met factoren om hun rol te bepalen in het induceren of interfereren met lens regeneratie.
2. Aggregatie van Iris cellen
- Om de platen met iris cellen toe te voegen 20μl van dispase oplossing voor de 400 ul medium, zacht zwenken.
- Incubeer de platen bij 27 ° C voor de overnachting.
- Pipet voorzichtig op en neer om cellen te verjagen
- Plaats cellen in eppendorfbuisje en spin gedurende 2 minuten bij 1000 rpm bij kamertemperatuur.
- Verwijder de medium en was door het toevoegen van 1 ml volledige L-15, spin 2 minuten bij 1000 rpm bij kamertemperatuur, verwijder medium.
- Gebruik 2000-7000 cellen per aggregaat. Voeg 200 ul L-15 per aggregaat in elke buis.
- Split-cellen (200 pi) in nieuwe eppendorf buizen.
- Draaien op 1000 rpm gedurende 2 min bij RT.
- Incubeer 48 uur bij 27 ° C.
3. Implantatie van Aggregrated cellen
- Maak een gleuf in het hoornvlies van het oog newt en verwijder de lens.
- Na de lens verwijderd, plaatst u de IPE cel totaal net onder de hoornvliesweefsel aan de ventrale zijde van het oog.
- De salamanders worden bewaard voor een maand om hen te laten regenereren van de lens.
4. Inbedding van Newt Eye
- Verwijder de newt ogen geïmplanteerd met het aggregaat en het in plaats fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Fix in 4% paraformaldehyde bij 4 ° C gedurende ten minste 4 uur of 's nachts.
- Wassen in PBS, 4 ° C gedurende 30 minuten.
- Behandelen met 0,85% zoutoplossing: 4 ° C, 30 minuten.
- Was in Saline / ethanol (1:1): RT gedurende 15 minuten.
- Was in 70% Ethanol: RT, 15 minuten. Een keer herhalen.
- Was in 85% ethanol en 95% ethanol bij RT, 30 minuten
- Was in 100% ethanol: RT, 30 minuten. Een keer herhalen.
- Bewaren bij 4 ° C of voort te zetten.
- Was in 100% xyleen: RT, 30 minuten. Een keer herhalen.
- Behandel met xyleen / paraffine (1:1): 60 ° C, 45 minuten.
- Behandel met 100% Paraffine: 60 ° C, 20 minuten. Herhaal het nog twee keer.
- Insluiten in inbedding mallen.
5. Snijden
- Bereid 15 pm delen van de embedded oog met behulp van een microtoom.
- Plaats het oog secties over een gelatine gecoate glijbaan en laat het op een dia warmer.
6. Vlekken
- Plaats de glaasjes in xyleen gedurende 10 minuten. Herhaal het nog een keer.
- Hydrate in: 100%, 95%, 80%, 70%, 30% ethanol gedurende 1 minuut per
- Spoel in DI water voor een minuut.
- Wassen in PBS gedurende 15 minuten.
- Was in PBST (0,2% Triton-X 100 in PBS) gedurende 15 minuten.
- Wassen in PBS gedurende 15 minuten.
- Plaats in het blokkeren van oplossing (10% geit secundair antilichaam) voor een uur.
- Plaats in het primair antilichaam voor overnachting.
- Was primair antilichaam in PBS gedurende 15 minuten.
- Was in PBST gedurende 15 minuten.
- Wassen in PBS gedurende 15 minuten.
- Plaats in het secundair antilichaam voor twee uur in het donker (1:100 verdunning in PBS).
- Wassen in PBS, PBST, en PBS gedurende 15 minuten en dan monteren.
- Let op de dia's onder een fluorescentie microscoop.
7. Representatieve resultaten:
Deze procedure van het kweken van newt iris cellen is gebruikt om de regeneratie mogelijkheden van de dorsale en de ventrale IPE cellen te bestuderen. Bovendien is het ook mogelijk om te studeren specifieke genen die bijdragen aan de lens regeneratie mechanisme in newt oog. Wanneer de cellen werden gekweekt gedurende 2 weken (figuur 1) ze kunnen worden getransfecteerd door de genen van hun functie bij lens regeneratie te onderzoeken. Van bijzonder belang zijn genen die de iris ventrale zou kunnen induceren. Sinds de ventrale iris cellen kunnen niet transdifferentiate op de lens (figuur 2) de inductieve functie van een kandidaat-gen kan worden bestudeerd. In het verleden, met behulp van deze techniek hebben we aangetoond dat wanneer zes-drie meer dan tot uiting in de aanwezigheid van retinoïnezuur lens inductie werd waargenomen vanaf het ventrale iris 6. In figuur 3 kunnen we zien dat de ventrale iris totale aanleiding gaf tot een volwassen en gedifferentieerde lens (pijlpunt), niet anders dan de ontvangende lens van de dorsale iris (pijl).
Figuur 1. a) Dorsale iris gepigmenteerde epitheliale cellen gekweekt in vitro voor een periode van 2 weken. b) Ventraal iris gepigmenteerde epitheliale cellen gekweekt in vitro voor een periode van 2 weken. Merk op dat pigmentatie blijft bestaan om deze fase zowel in dorsale en ventrale iris cellen.
Figuur 2. Regeneratie vermogen van de gekweekte cellen IPE. a) Lens inductie van dorsale IPE cel aggregaat (pijlpunt). Host lens inductie van de dorsale iris (pijl), di: dorsale iris, vi: ventrale iris, le: lens epitheel, lf: lens vezels. b) Geen lens inductie van ventrale IPE cel aggregaat (pijlpunt). Host lens inductie van de dorsale iris (pijl).
Figuur 3. Lens inductie van ventrale aggregaat getransfecteerd met zes-3 en behandeld met retinoïnezuur. Host lens inductie van de dorsale iris (pijl). Lens inductie van ventrale aggregaat (pijlpunt).
Discussion
Dit protocol heeft een in vitro systeem voor regeneratie lens mechanismen studie in salamanders. Omdat de aggregaten (ofwel dorsale of ventrale trouw volgen hun in vivo gedrag tijdens de regeneratie van deze techniek kan de enorme inspanning die nodig is voor de transgenese in salamanders en kan worden gebruikt voor versterking van de functie, alsmede het verlies van de functie experimenten 7,8,9 te verlichten. Ook , kunnen de aggregaten of de irissen in zijn geheel gemakkelijk worden behandeld met groeifactoren en onderzoeken de effecten zoals beschreven in dit protocol. Bijvoorbeeld de rol van de BMP-traject is bestudeerd met behulp van deze techniek 6.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door een NIH subsidie Ey10540 naar PAT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lugol’s solution | Sigma-Aldrich | L-6146 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | E-10521 | |
| Dispase | GIBCO, by Life Technologies | 17105-041 | |
| Trypsin 1:250 | GIBCO, by Life Technologies | 27250018 | |
| L-15 ( Leibovitz) | Sigma-Aldrich | L-4386 | |
| DNase 1 | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | |
| Kanamycin Sulfate | GIBCO, by Life Technologies | 100x, 15160 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Fungizone (amphotericin B solution) | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| 24 well collagen coated plate | BD Biosciences | 354408 |
References
- Tsonis, P. A.
- Tsonis, P. A., Madhavan, M., Tancous, E. E., Del Rio-Tsonis, K. A newt's eye view of lens regeneration. Int. J. Dev. Biol. 48, 975-980 (2004).
- Del Rio-Tsonis, K., Tsonis, P. A. Eye regeneration at the molecular age. Dev. Dyn. , 226-2211 (2003).
- Okamoto, M., Ito, M., Owaribe, K. Difference between dorsal and ventral iris in lens producing potency in normal lens regeneration is maintained after dissociation and reaggregation of cells from the adult newt, Cynops pyrrhogaster. Develop Growth Differ. 40, 11-18 (1998).
- Hayashi, T. Highly efficient transfection system for functional gene analysis in adult amphibian lens regeneration. Develop Growth Differ. 43, 361-370 (2001).
- Grogg, M. W. BMP inhibition-driven regulation of six-3 underlies induction of newt lens regeneration. Nature. 438, 858-862 (2005).
- Nakamura, K. miRNAs in Newt Lens Regeneration: Specific Control of Proliferation and Evidence for miRNA Networking. PLoS One. 5, e12058-e12058 (2010).
- Madhavan, M. The role of Pax-6 in lens regeneration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14848-14853 (2006).
- Maki, N. Oocyte-type linker histone B4 is required for transdifferentiation of somatic cells in vivo. FASEB J. 24, 3462-3467 (2010).
