Métodos para ECG Avaliação de Indicadores de risco cardíaco e Susceptibilidade à Aconitina arritmias induzidas em ratos após a Estado Epiléptico

Resumo

Técnicas de medição da atividade elétrica do coração pelo eletrocardiograma (ECG), e análise de fatores de risco cardíaco e susceptibilidade a arritmias após estado de mal epiléptico (SE) no rato são descritos.

Resumo

Letais arritmias cardíacas contribuem para a mortalidade em uma série de condições patológicas. Vários parâmetros obtidos a partir de um não-invasiva, eletrocardiograma facilmente obtidos (ECG) são estabelecidas, bem validadas indicadores prognósticos de risco cardíaco em pacientes que sofrem de uma série de cardiomiopatias. Aumento da freqüência cardíaca, diminuição da variabilidade da freqüência cardíaca (VFC), e aumento da duração e da variabilidade da atividade elétrica cardíaca ventricular (intervalo QT) são indicativos de maior risco cardíaco ^1-4. Em modelos animais, é importante comparar esses ECG derivados variáveis ​​e susceptibilidade a arritmias induzida experimentalmente. Infusão intravenosa do agente aconitina arritmogênica tem sido amplamente utilizada para avaliar a susceptibilidade a arritmias em uma variedade de condições experimentais, incluindo modelos animais de depressão e hipertensão ^{5 6, 7} após o exercício e exposição a poluentes atmosféricos ^8, bem como a determinação dos antiarrítmicos eficácia dos agentes farmacológicos ^9,10.

Note-se que a dispersão do intervalo QT em humanos é uma medida da variação do intervalo QT em todo o conjunto completo de cabos de um padrão de 12 derivações ECG. Consequentemente, a medida de dispersão QT do ECG duas derivações em ratos descrita neste protocolo é diferente do que o calculado a partir de registros ECG humano. Isso representa uma limitação na tradução dos dados obtidos de roedores à medicina clínica humana.

Estado de mal epiléptico (SE) é uma crise única ou uma série de convulsões recorrentes continuamente com duração superior a 30 min ^{11,12 11,12,} e os resultados na mortalidade em 20% dos casos ^13. Muitas pessoas sobrevivem da SE, mas morrer dentro de 30 dias ^14,15. O mecanismo (s) desta mortalidade tardia não é totalmente compreendido. Tem sido sugerido que arritmias ventriculares letais contribuir para muitas destas mortes ^14-17. Além de SE, os pacientes com crises recorrentes de forma espontânea, epilepsia ou seja, estão em risco de morte súbita prematura e inesperada associada a epilepsia (SUDEP) ^18. Tal como acontece com SE, os mecanismos precisos mediação SUDEP não são conhecidos. Tem sido proposto que as anormalidades e arritmias ventriculares resultando uma contribuição significativa ^18-22.

Para investigar os mecanismos de apreensão relacionados com morte cardíaca, ea eficácia de terapias cardioprotetor, é necessário obter os dois indicadores ECG derivados de risco e avaliar a susceptibilidade a arritmias cardíacas em modelos animais de doenças convulsivas ^23-25. Aqui nós descrevemos métodos para o implante de eletrodos ECG na Sprague-Dawley laboratório de ratos (Rattus norvegicus), seguindo SE coleta e análise de gravações de ECG, e indução de arritmias durante a infusão intravenosa de aconitina.

Estes procedimentos podem ser usados ​​para determinar diretamente as relações entre ECG derivados medidas de atividade elétrica cardíaca e susceptibilidade a arritmias ventriculares em modelos de ratos de distúrbios convulsivos, ou qualquer patologia associada com maior risco de morte súbita cardíaca.

Protocolo

1. Materiais para Construção

1. Um cateter da veia jugular é construído a partir de uma peça (100 mm) da PE-50 tubos de polietileno, chanfrada em uma extremidade, e depois preenchido com solução salina com heparina (50 U de heparina / ml salina).
2. A gravação do ECG eletrodos são construídos a partir de dois comprimentos de 100 mm de fio de prata isolados (30AWG). Uma extremidade de ambos os fios é despojado e soldada a um microconector, eo isolamento é torcido para formar um terceiro fio que é usado como terra. Cinco milímetros de isolamento é retirado da extremidade distal dos fios e descartados.

2. Implantação do cateter da veia jugular

1. Anesthetize o animal pela administração de uretano, ip (1,2 g / kg).
2. Verifique regularmente (intervalos de 10 min) profundidade da anestesia através da avaliação da resposta retirada pedal e / ou reflexos oculares. Se necessário, complementar a anestesia.
3. Depois que o animal está no plano adequado de anestesia, raspar o lado direito do pescoço da clavícula até o queixo.
4. Faça uma incisão longitudinal (10-15 mm) na pele acima da artéria carótida e abrir a incisão.
5. Usando técnicas de dissecção romba, espalhar o músculo subjacente para localizar e isolar a veia jugular direita.
6. Coloque dois pedaços de seda cirúrgica (# 2) sob a veia jugular, e posicione a sutura da porção mais rostral e caudal da incisão. Amarrar a ligadura rostral interromper o fluxo através da veia.
7. Recolha a ligadura caudal para levantar o navio fora do tecido subjacente e fazer um pequeno corte. Em seguida, insira a extremidade chanfrada da heparina cateter preenchido PE-50 (50 U / ml salina) de polietileno (100 mm de comprimento), e avançar a ponta cerca de 8 mm ao nível do átrio direito.
8. A fim de garantir o cateter, amarrar a ligadura caudal em torno de ambos navio e cateter. Finalmente, feche a ferida com clips ou ferida ou sutura.
9. Durante a implantação do cateter, a extremidade exposta ou é presa com uma pinça hemostática ou conectado para evitar o refluxo de sangue antes de apego a uma bomba de infusão.

3. Implantação de eletrodos CG

1. Coloque o animal em suas costas e raspar o peito.
2. Para a colocação dos eletrodos, fazer duas incisões longitudinais (≈ 10 mm), um no canto superior direito e um nos quadrantes inferior esquerdo do peito, ea pele sobrejacente livre para expor os músculos do tórax.
3. Suture um dos expostos de 5 mm pontas dos eletrodos de prata-wire para os músculos do tórax em cada uma das áreas expostas, e coloque o eletrodo terra por via subcutânea.
4. Feche a incisões com grampos de sutura e ligue o microconector para o dispositivo de gravação.
5. Envolva o animal frouxamente em uma toalha para manter a temperatura corporal durante o procedimento.

4. Gravação de ECG

são feitas usando um Powerlab Aquisição de Dados do Sistema e Macintosh computador ou hardware similar / software (amplificado, 50X; filtrado, 1000-1000 Hz).
1. Depois de um período de equilíbrio 20-30 min, o registro ECG durante 20 min.

5. Indução de arritmias ventriculares

1. Coloque o cateter da veia jugular a uma seringa remoto colocado em uma bomba de infusão programável.
2. Iniciar a infusão aconitina a uma taxa para fornecer uma dose constante de 5 ug / kg / min durante 7 minutos.
3. Após a fibrilação ventricular ou o fim do período de infusão, eutanásia do animal usando um procedimento aprovado.

6. Análise do ECG

1. O intervalo QT representa a duração total da atividade elétrica ventricular. Fig. 1 mostra um modelo de registro ECG ea duração do intervalo QT. Calcule o tempo médio entre o início da onda Q e terminação da onda T para todos os batimentos cardíacos gravados ao longo de um intervalo de cinco minutos obtida durante o período de gravação de 20 min.
2. Para corrigir o intervalo QT para as diferenças na freqüência cardíaca (QTc), use a fórmula de Bazett, QTc = QT / (RR) ^½, Onde RR é o intervalo médio entre os batimentos. O intervalo RR é calculada como a duração entre sucessivas ondas Q obtidos durante o período analisado.
3. A dispersão QT (QTd) é calculado subtraindo-se o QT mínima do QT máxima registrada para cada animal.

7. Análise da variabilidade da freqüência cardíaca

Software (ie LabChart 7, ADInstruments, Inc.) que analisam a variabilidade nos intervalos RR obtidos durante o período de análise são usados ​​para o cálculo automatizado de variância temporal e / ou espectral da frequência cardíaca.

8. Análise da susceptibilidade a arritmias ventriculares

Calcular a latência do início da infusão aconitina à contração ventricular prematura primeiro (PVC, fig. 2, Painel 1), taquicardia ventricular (VT, Fig, 2, Painel 2) e fibrilação ventricular (VF, Fig. 2. Painel 3 ).

9. Resultados representante

Figura. 3 ilustra uma medida da VFC no domínio espectral (root mean squared do desvio padrão do intervalo RR, RMSSD) em ratos controle e em animais que foram submetidos SE uma semana antes do teste. Esta medida da VFC, o que representa mudanças no controle parassimpático da função cardíaca ²⁶, É significativamente diminuída em animais após estado de mal epiléptico. Fig. 4 mostra que tanto o intervalo QT corrigido (QTc, Painel A) e dispersão do QT (QTd, Painel B) são significativamente aumentados de duas semanas após SE ²⁷. Tomados em conjunto, esses dados prevêem que SE aumenta o risco de arritmias ventriculares. Esta previsão é confirmada pelos resultados que os períodos de infusão aconitina necessário para levar a arritmias experimental (PVC, VT, VF) observado nestes estudos foram significativamente menores nos animais após SE (Fig. 5) ²⁷.

Figura 1. Modelo de gravação ECG de um batimento cardíaco normal, mostrando P, QRS e ondas T. O intervalo QT é calculado como o tempo entre as linhas tracejadas.

Figura 2. Painel 1) Contrações ventriculares prematuras (PVC) são isolados contracções dos ventrículos (B) que ocorrem entre batimentos cardíacos normais (A). Gravações de PVC são caracterizadas pela ausência de ondas P e T. Painel 2 A taquicardia ventricular (VT) é uma série de contrações ventriculares múltiplas (C) que ocorrem sem batimentos cardíacos intervir normal (A). Painel 3 A fibrilação ventricular (FV) é a falta de ritmo perceptível e nenhuma associação entre QRS e as ondas P (D).

Figura 3. O root mean squared do desvio padrão (RMSSD; ms) dos intervalos entre os batimentos cardíacos observados em ratos controle e em animais submetidos a status epilepticus (SE) 1 semana antes do teste. ** P <0,01 comparado ao controle.

Figura 4. A média do intervalo QT corrigido (Painel A) e dispersão do QT (Painel B) calculado a partir de gravações de ECG obtidos de animais controle (Cont) e de ratos submetidos a estado de mal epiléptico (SE) duas semanas antes do teste. * P <0,05 em comparação com Cont. (Metcalf, et al. Am. J. Physiol. Coração e Circ, 2009, Am Soc Physiol, usada com permissão do ²⁷).

Figura 5. As latências (s) entre o início da infusão aconitina ea primeira contração ventricular prematura (PVC), taquicardia ventricular (VT) e fibrilação ventricular (VF) em animais controle (Cont) e ratos submetidos a estado de mal epiléptico (SE) duas semanas antes do teste. * P <0,05, ** p <0,01 em comparação com Cont. (Metcalf, et al. Am. J. Physiol. Coração e Circ, 2009, Am Soc Physiol, usada com permissão do ²⁷).

Discussão

Dois aspectos dos procedimentos descritos são de importância crítica. Em primeiro lugar, a taxa de administração aconitina para o coração deve ser equivalente em animais. Isto requer a colocação consistente das dicas veia jugular cateter em relação ao coração, e ajuste cuidadoso da taxa de infusão. A taxa de entrega aconitina ao coração deve ser igual, a fim de avaliar adequadamente o aparecimento de arritmias ventriculares em relação a susceptibilidade alterada. Se a entrega aconitina varia, então a latência para arrit...