Summary
De eileider (FT) is in opkomst als een alternatieve site van oorsprong voor de sereuze ovariumcarcinoom (SOC). Dit protocol beschrijft een nieuwe methode voor de isolatie en
Abstract
Epitheliale eierstokkanker is een belangrijke oorzaak van kanker bij vrouwen de sterfte in de Verenigde Staten. In tegenstelling tot andere vrouwen-specifieke vormen van kanker, zoals borst-en baarmoeder carcinomen, waar de dood is gedaald in de afgelopen jaren hebben eierstokkanker genezingspercentages bleef relatief onveranderd de afgelopen twee decennia een. Dit is grotendeels te wijten aan het gebrek aan de juiste screening tools voor detectie van vroege stadium van de ziekte, waar een operatie en chemotherapie zijn het meest effectief 2, 3. Als gevolg daarvan, de meeste patiënten aanwezig met gevorderd stadium van de ziekte en diffuse abdominale betrokkenheid. Dit wordt verder bemoeilijkt door het feit dat kanker van de eierstokken is een heterogene ziekte met meerdere histologische subtypes 4, 5. Sereuze ovariumcarcinoom (SOC) is de meest voorkomende en agressief subtype en de vorm die het meest vaak geassocieerd met mutaties in de BRCA genen. Huidige experimentele modellen in dit gebied gekenmerkt door het gebruik van kanker cellijnen en muismodellen beter inzicht in de genetische gebeurtenissen initiëren en pathogenese van de ziekte 6, 7. Onlangs heeft de eileider naar voren als een nieuwe site voor de oorsprong van de SOC, met de eileider (FT) secretorische epitheliale cel (FTSEC) als de voorgestelde cel van oorsprong 8, 9. Er zijn momenteel geen cellijnen of cultuur ter beschikking van de FT epitheel of de FTSEC studie. Hier beschrijven we een nieuwe ex vivo cultuur systeem waar primaire menselijke FT epitheliale cellen worden gekweekt op een manier die hun architectuur, polariteit, immunofenotype, en de respons op fysiologische en genotoxische stressoren behoudt. Deze ex vivo model biedt een nuttig instrument voor de studie van SOC, waardoor een beter begrip van hoe tumoren kunnen ontstaan uit dit weefsel, en de mechanismen die betrokken zijn in de tumor initiatie en progressie.
Protocol
1. Collageen Voorbereiding en Filter Coating.
- Ter voorbereiding op de menselijke placenta collageen, tweeze uit 30 mg van de menselijke placenta collageen en zet op de top van 50 ml gedestilleerd water (dH 2 O) in een bekerglas van 500 ml met een roerstaafje.
- Voeg 100 μls ijsazijn rechtstreeks op collageen die het gemakkelijker maken om op te lossen. Warm tot 37 ° C en roer het aan het collageen te ontbinden. Het moet lossen in 20-30 minuten. Als collageen strengen in oplossing blijven, zullen filter sterilisatie moeilijk zijn.
- Verdun de 50 ml bouillon met 450 ml van dH 2 O en filter-gesteriliseerd met een 0,2 um membraan. Dit is de laatste werkende oplossing. Bewaren bij 4 ° C.
- Bereid Transwell filter membranen door het bekleden ze met collageen (50-100 pi) 's nachts. Gekoeld collageen moet worden opgewarmd tot kamertemperatuur en vervolgens toegevoegd aan het bovenste compartiment om het membraan te dekken 's nachts en bij RT. Voordat plating de gedissocieerde primaire eileider (FT) epitheel (zie hieronder) op de Transwell filters, was de filters drie keer in 1X fosfaat zoutoplossing (PBS) ten minste een uur gebufferd voor gebruik om de overtollige collageen te verwijderen.
2. Tissue Collection en dissociatie.
- Verse eileider (FT) fimbria moet worden verzameld in steriele 1X PBS in een centrifugebuis van 50 ml en bleef op ijs voorafgaand aan de verwerking prompt in een steriele weefselkweek kap.
- Was het weefselmonster een keer in 20 ml gekoelde 1X PBS (als monster is verzameld in een ander type medium of is bloederig was op zijn minst 3x om zich te ontdoen van te krijgen zo veel bloed en buitenlandse media mogelijk als dit kan interfereren met plating efficiëntie).
- Met behulp van steriele pincet overdracht FT aan een 10 cm weefselkweek schotel met een beetje PBS en, met behulp van een steriel scalpel en pincet steriele, snijd overlangs om de blootstelling van de epitheelcellen te maximaliseren. Open de fimbria, zodat het niet langer een buis, maar een bijna vlakke plaat van weefsel. En snijd in kleinere, maar nog steeds terug te vinden zijn stukjes (ongeveer 3 mm in diameter).
- Overdracht stukken aan 45 ml koud dissociatie media (MEM met 1,4 mg / ml pronase en 0,1 mg / ml DNase) in een 50 ml buis.
- Rock voorzichtig bij 4 ° C gedurende 24 tot 72 uur. (Uit ervaring, 48 uur is optimaal). Te bedragen van dissociatie controleren, zet een daling van dissociatie media op een dia en controleer hoeveelheid klonteren en levensvatbaarheid van het weefsel (het slaan trilharen cellen). U wilt zowel de afzonderlijke cellen en een aantal kleine groepjes te zien.
3. Eileider Plating.
- Wanneer de hoeveelheid van epitheelcel dissociatie optimaal is, inactiveren van de media door het toevoegen van 10% volume van FBS. Omgekeerde een paar keer om de celsuspensie los in kleinere aggregaten.
- Laat grote klonten weefsel (stromale weefsel) te vestigen in de bodem van de buis. Verwijder de media met epitheliale cellen in een seconde 50 ml buis.
- Voeg 50 ml koud MEM (geen FBS) naar de oorspronkelijke 50 ml tube. Omkeren om extra cellen te verzamelen. Verzamel media in een derde 50 ml tube (als de steekproef is zeer groot en een groot aantal cellen wordt verwacht, deze stap kan worden herhaald tot cel collectie te maximaliseren). De grote stukken van de stromale / extracellulaire weefsel kan nu worden weggegooid. Je hebt nu twee 50 ml tubes celsuspensie. Centrifugeer bij 1000 rpm gedurende 5 minuten en zuig dissociatie media uit cel pellets.
- Resuspendeer in ongeveer 5-10 ml van USG media (DMEM: F12 aangevuld met 2% en 1% USG Pen Strep) verwarmd tot 37 ° C. Pipet voorzichtig. Wees voorzichtig niet al te krachtig pipet, omdat dit kan schade aan het epitheel cellen en verminderen de kwaliteit van culturen. Er moeten enkele cellen en kleine groepjes (figuur 1).
- Transfer naar Primaria cultuur gerechten en incubeer een minimum van 1 uur of tot 3 uur. Fibroblasten en rode bloedcellen zal vasthouden aan het plastic, maar de FT epitheelcellen niet. Neem een kijkje op de plaat na een uur om te zien of er iets kleven. De aanwezigheid van trilharen cellen kan worden gezien door op te merken het slaan van de trilharen.
- Tijdens deze incubatie kan collageen gecoate filters worden gewassen en klaar gemaakt voor mobiele plating (zie stap 1.4)
- Na 1-3 uur van incubatie op de Primaria platen, de celsuspensie over te dragen aan een 15 ml buis en spoel de Primaria plaat met 5 ml USG media, het overdragen van deze media om de buis tot een uiteindelijk volume van 15 ml. Centrifugeer bij 1000 rpm gedurende 5 minuten.
- Zorgvuldig aspireren media en niet te verstoren de cel pellet. Te oordelen naar de korrelgrootte, opnieuw in suspensie in de juiste hoeveelheid van USG media. (Meestal tussen 1-3 ml) Minder is beter in het begin, zodat u kunt verder te verdunnen als dat nodig is. Hersuspenderen voorzichtig.
- Voeg 10 ul van de geresuspendeerde cellen aan een hemacytometer en bepaal de celdichtheid. Tips: U bent op zoek naar epitheliale cellen die een duidelijk donkere celmembraan hebben en niet-zuilvormig. U kunt ook rekenen trilharen cellen die zeker bewegen. Kleinere cellen die een halo appearan hebbence zijn rode bloedcellen en mag niet worden meegeteld. Er zullen een aantal klonteren worden, dus je moet schatten die in je cellen. Het zaaien doel is 1,65 x10 5 cellen / membraan, of ten minste 75% filter dekking (figuur 1). Als de cellen te dun bedekt, zal cellen niet in staat zijn om een volledige epitheliale laag te vormen.
- Voeg 500 ul van de USG media bodem van de put van een 24 wells plaat en plaats Transwell. Het benodigde volume van de FT celsuspensie (zie hierboven) kan vervolgens worden toegevoegd aan elk membraan, dit is typisch 100 pl.
- Incubeer en groeien gedurende 1-2 dagen zonder storende bovenkant van membraan. U kunt de media op de basale zijde tijdens die dag indien nodig. Na 1-2 dagen, kunt u zorgvuldig spoelen van de top met USG media en voeg een kleine hoeveelheid (50-100 pi) van media op de top van de membraan. Het is gemakkelijker om de samenvloeiing van celculturen te bepalen of de media wordt verwijderd van de apicale zijde van de filters voor microscopie. Het onderste compartiment moet altijd bevatten media. Zodra culturen zijn volledig confluent (normaal gesproken binnen 5 dagen), moet het bedrag van de media die tot reizen door de filters van de basale te apicale kanten te verwaarlozen zijn.
- Wijzig de basale media eens in de twee dagen voor de eerste 10 dagen. Het onderste compartiment moet altijd de media te houden cellen in leven. Zodra de cellen hebben gevormd een strakke epitheellaag (figuren 1 en 2) ze kunnen worden gebruikt in verdere studies, zoals immunofluorescentie (IF) of immunohistochemie (IHC).
4. Membraan Processing.
- Membraan verwerking is afhankelijk van het soort onderzoek dat zal worden uitgevoerd, maar meestal gaat om het verwijderen van het filter uit de Transwell inserts.
- De filters zijn meestal 3 maal gewassen in 200 ul van 1X PBS voor de verwijdering.
- Aspireren PBS van de apicale en basale kant van de filters. Dit dient te gebeuren een goed op een tijd om de membranen te voorkomen dat uitdroogt.
- Verwijder het invoegen van de plaat, draai hem ondersteboven en gebruik een steriele scalpel te snijden rondom het membraan. Probeer het membraan in een keer te verwijderen door het maken van rechte sneden rond het membraan rand, in plaats van het slepen van de scalpel rond de rand.
- Gebruik een pincet om de filter te verwijderen uit de voegen, het bijhouden van welke kant de cellen op. Het filter kan dan worden verwerkt voor IF, IHC, etc. naargelang het geval.
- Voorbeeld: voor IF studies, het filter (na fixatie, permeabilisatie, blokkeren en incubatie met de juiste antilichamen, volgens standaard IF procedures) moet worden gelegd op een dia, wordt cellen naar boven, Vectashield met DAPI vallen op het filter en bedekt met een glazen dekglaasje aan.
5. Representatieve resultaten:
De transwell filters kunnen gemakkelijk worden verwijderd om de ex vivo epitheel te onderzoeken door zowel immunohistochemie (IHC) en immunofluorescentie (IF). Met behulp van lineage specifieke markers, kan men beeld en kwantificeren van de secretoire (Pax8 positief) en trilharen (Sall2 positieve) celcompartimenten in deze culturen (figuur 3). Bovendien, met behulp van deze markers kan men controleren hoe elk type cel reageert op de verschillende fysiologische signalen 10. Dit systeem is gebruikt om de veranderingen in het secretoom en intracellulaire phosphoproteome van FT epitheel karakteriseren in reactie op verschillende stimuli.
Figuur 1. Illustratie geeft hoe de ex vivo culturen zijn gegenereerd op basis van primaire menselijke eileider weefsel. Eileider fimbriële weefsel wordt verkregen uit de chirurgische suite en gehakt tot kleine fragmenten 1 die gewassen en geïncubeerd met dissociatie media voor 24-72 uur 2 genereren. Na dissociatie is voltooid, worden de weefselfragmenten bezinken naar de bodem van de incubatie buis en de media die de gedissocieerde epitheliale cellen geoogst 3. De efficiëntie van dissociatie kan worden gecontroleerd door onderzoek op grond van een fase-contrast microscoop 4. De gedissocieerde epitheliale cellen worden vervolgens gekweekt op Primaria platen om te helpen fibroblast en hematopoietische cellen die steevast gemengd met de epitheelcellen 5 te verwijderen. Zodra de niet-epitheliale cellen naar behoren worden verwijderd, zijn de epitheliale cellen gezaaid op transwell filters die zijn gecoat met de menselijke placenta collageen 5. De media wordt verzorgd door diffusie door de transwell van onderen. De culturen worden geïncubeerd voor 24-48 uur en daarna de apicale media wordt verwijderd. De ex vivo culturen worden dan toegestaan om te groeien voor 5-8 dagen om een volledige, complete gazon formulier aan de transwell filters. De ex vivo culturen kunnen op rendabele wijze worden gehandhaafd in deze staat tot 4 weken. De cartoon 5 toont een weergave van de volwassen ex vivo cultuur met een voorbeeld van een filter uit de insert en gekleurd met hematoxylin en eosine (H & E) om de polariteit en de architectuur van de ex vivo epitheel aan te tonen.
Figuur 2. Helderveld microscopie van FT ex vivo culturen. Transwell inserts zijn bekleed met menselijke placenta collageen 0.4μm poriën zijn zichtbaar (a). FT epitheliale cellen worden gekweekt op de collageen gecoate inserts (b), waar ze vormen een epitheellaag (c). Sommige puin is normaal gezien houden aan cellen in het epitheel cultuur (aangegeven met pijlen), meestal aan trilharen cellen.
Figuur 3. FT ex vivo cultuur immunofluorescentie (IF). Voorbeelden van IF beelden van ex vivo culturen gefixeerd en gekleurd met antilichamen tegen (een) secretorische (Pax8) en (d) trilharen cel (Sall2) markers. DAPI wordt gebruikt als een controle voor de locatie van celkernen (blauw) (b en e) en samengevoegd antistof en DAPI kleuring is ook te zien (c en f). Het aantal cellen is afhankelijk van de lengte van tijd dat de cellen in cultuur (Pax8 kleuring, 7 dagen; Sall2 kleuring, 3 dagen).
Discussion
De identificatie van de FT als kandidaat plaats van oorsprong voor SOC biedt de mogelijkheid voor fundamenteel en translationeel onderzoek gericht op het ontcijferen van de mechanismen die het koppelen van bekende risicofactoren en de werkelijke sereuze kankerverwekkend proces. Kritiek voor dit is de ontwikkeling van soepel model systemen die ons in staat stelt om te beginnen met het testen van de hypothese dat de FTSEC is een cel-van-oorsprong bekken sereuze carcinomen. De ex vivo cultuur model hierin beschreven is een nieuw systeem dat de isolatie en de co-cultuur van de primaire FT secretoire en trilharen cellen maakt op een manier die de morfologie en biologie van de inheemse FT epitheel bewaart. Met behulp van dit systeem, hebben we onlangs gekarakteriseerd de secretoom van dit epitheel en de manier waarop het epitheel reageert op mechanische en genotoxische letsels 10. Ovulatie, een belangrijke risicofactor in verband met eierstokkanker ontstaan van tumoren, wordt gekenmerkt door een combinatie van weefselbeschadiging, ontstekingsmediatoren, groeifactoren, hormonen en 11. Dit systeem kan worden gebruikt om het effect van een ovulatie milieu van de reacties en levensvatbaarheid van secretorische en trilharen cellen te bestuderen. Bovendien kan de invloed van andere celtypes (dat wil zeggen ontstekingscellen) worden onderzocht om een beter begrip van de gebeurtenissen toestaan dat rijden cel-type differentiatie en de factoren die bijdragen aan de neoplastische transformatie van deze cellen. Vergelijkbare modellen zijn beschreven in andere weefsels waar gepolariseerde epitheel aanwezig is. Bijvoorbeeld, in gepolariseerde primaire culturen van luchtwegepitheel, werd het effect van hereguline op de celgroei en de respons op cellulair letsel beoordelen 12. Deze types van model systemen bieden een nieuwe en handige manier om de initiatie en pathogenese van tumoren die ontstaan uit epitheliale weefsels te bestuderen, en dit is van cruciaal belang in weefsels zoals de FT, waar geen enkele cellijnen bestaan momenteel, en waar er een grote nodig voor de identificatie van de belangrijkste wegen en de ontwikkeling van nieuwe behandelingsstrategieën.
Disclosures
Dr Drapkin is een adviseur van Novartis Pharmaceuticals. Geen enkele andere auteurs verklaren mogelijke belangenconflicten.
Acknowledgments
Wij danken de faculteit, jongens, bewoners, en arts-assistenten van het Brigham and Women's Hospital, afdeling Pathologie voor het maken van weefsel beschikbaar is voor deze studies. Dit werk werd ondersteund door subsidies voor onderzoek van de NIH / National Cancer Institute (P50 CA105009, K08 CA108748, U01 CA152990), Ovarian Cancer Research Fund, The May Kay Foundation, Novartis Pharmaceuticals, Robert en Deborah eerste fonds, Randi en Joel Cutler Ovariumcarcinoom Research Fund, Marsha Rivkin Foundation - Scientific Scholar Award, AACR - George en Patricia Sehl Fellowship for Cancer Research Genetica, en de Amerikaanse Arts Fellowship voor Geneeskunde in Israël - Claire en Emmanuel G. Rosenblatt Foundation Grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagen from human placenta (Bornstein and Traub Type IV) | Sigma-Aldrich | C7521 | |
| DMEM:F12 media | Cellgro | 15-090-CV | |
| Ultroser G | Crescent Chemical Company | 67042 | Add 20 ml of DMEM:F12 to stock bottle and use 10mls per 500 ml of media (2% final concentration) |
| Pen Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| BD Primaria culture plates | BD Biosciences | 353802 | |
| 24 well Transwell Permeable supports | Corning | 3470 | Clear, 6.5 mm insert, 0.4 μm pore size, treated polyester |
| MEM (Minimal Essential Media) | Cellgro | 10-010-CV | |
| Pronase | Roche Group | 11459643001 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Sall2 antibody | Harvard - T. Benjamin Lab | Gift | 1:20 dilution |
| Pax8 antibody | Proteintech | 10336-1-AP | 1: 1000 dilution |
References
- Jemal, A., Siegel, R., Xu, J., Ward, E.
- Markman, M., Walker, J. L. Intraperitoneal chemotherapy of ovarian cancer: a review, with a focus on practical aspects of treatment. J. Clin. Oncol. 24, 988-994 (2006).
- Liu, J., Matulonis, U. A.
- Cannistra, S. A.
- Kurman, R. J., Shih, I. M. The origin and pathogenesis of epithelial ovarian cancer: a proposed unifying theory. Am. J. Surg. Pathol. 34, 433-443 (2010).
- Fong, M. Y., Kakar, S. S. Ovarian cancer mouse models: a summary of current models and their limitations. J Ovarian Res. 2, 12-12 (2009).
- Shan, W., Liu, J. Epithelial ovarian cancer: focus on genetics and animal models. Cell Cycle. 8, 731-735 (2009).
- Levanon, K., Crum, C. P., Drapkin, R. New insights into the pathogenesis of serous ovarian cancer and its clinical impact. J. Clin. Oncol. 26, 5284-5293 (2008).
- Karst, A. M., Drapkin, R. Ovarian cancer pathogenesis: a model in evolution. J Oncol. 2010, 932371-932371 (2010).
- Levanon, K., Ng, V., Piao, H. Y., Zhang, Y., Chang, M. C., Roh, M. H., Kindelberger, D. W., Hirsch, M. S., Crum, C. P., Marto, J. A., Drapkin, R. Primary ex vivo cultures of human fallopian tube epithelium as a model for serous ovarian carcinogenesis. Oncogene. 25, 1103-1113 (2010).
- Landen, C. N. Jr, Birrer, M. J., Sood, A. K. Early events in the pathogenesis of epithelial ovarian cancer. J. Clin. Oncol. 26, 995-1005 (2008).
- Vermeer, P. D., Einwalter, L. A., Moninger, T. O., Rokhlina, T., Kern, J. A., Zabner, J., Welsh, M. J. Segregation of receptor and ligand regulates activation of epithelial growth factor receptor. Nature. 422, 322-326 (2003).
