"Bioluminescent 'Phage Reporter para a detecção de patógenos bacterianos Categoria A

Resumo

Um método simples para a identificação de patógenos bacterianos prioridade é a utilização de fagos repórter geneticamente modificadas. Estes fagos repórter, que são específicas para sua espécie de hospedeiro particular, são capazes de transdução rapidamente uma resposta de sinal bioluminescentes para células hospedeiras. Relata-se o uso de fagos repórter para a detecção de Yersinia pestis.

Resumo

Yersinia pestis e Bacillus anthracis Categoria A são bactérias que são os agentes causadores da praga e antraz, respectivamente ^1. Embora a ocorrência natural de ambas as doenças "agora é relativamente rara, a possibilidade de grupos terroristas com estes patógenos como uma arma biológica é real. Por causa da comunicabilidade inerente da doença, evolução clínica rápida e alta taxa de mortalidade, é fundamental que um surto ser detectados rapidamente. Portanto metodologias que proporcionam a rápida detecção e diagnóstico são essenciais para garantir a implementação imediata de medidas de saúde pública e ativação de gestão de crises.

Fago recombinante repórter pode proporcionar uma abordagem rápida e específica para a detecção de Y. pestis e B. anthracis. Os Centros de Controle e Prevenção de Doenças atualmente usam os ensaios de lise clássica fago para a identificação confirmada destes patógenos bacterianos ^2-4. Estes ensaios aproveitar naturalmente fago que são específicas e lítico para seus hospedeiros bacterianos. Após o crescimento durante a noite da bactéria cultivada na presença do fago específico, a formação de placas (lise bacteriana) fornece uma identificação positiva do alvo bacteriana. Embora estes ensaios são robustos, eles sofrem de três problemas: 1) eles são em laboratório; 2) requerem isolamento bacteriano e cultivo da amostra suspeita, e 3) eles levam 24-36 h para completar. Para tratar dessas questões, fago recombinante repórter "light-com a tag" foram geneticamente modificados através da integração do Vibrio harveyi luxAB genes no genoma de Y. pestis e B. anthracis fago específico ^5-8. O fago repórter resultando luxAB foram capazes de detectar o seu alvo específico, rapidamente (em minutos) e com sensibilidade conferir um fenótipo bioluminescentes para células receptoras. Importante, a detecção foi obtido tanto com células cultivadas ou destinatário com mock-infectados amostras clínicas ^7.

Para fins de demonstração, aqui descrever o método para a detecção fago-mediada de um Y. conhecida pestis isolar usar um fago repórter luxAB construído a partir da praga CDC diagnóstico fago ΦA1122 ^6,7 (Figura 1). Um método semelhante, com pequenas modificações (por exemplo, mudança na temperatura de crescimento e media), pode ser usado para a detecção de B. anthracis isola usando o B. anthracis Wβ fago repórter:: luxAB ^8. O método descreve a transdução mediada por fagos de um fenótipo biolumescent para Y. cultivada pestis células que são posteriormente medido com um luminômetro. As principais vantagens deste método sobre os ensaios de lise tradicional fago é a facilidade de uso, os resultados rápidos, e a capacidade de testar múltiplas amostras ao mesmo tempo em um formato de placa de 96 poços de microtitulação.

Figura 1. Esquema de detecção. O fago são misturados com a amostra, o fago infecta a célula, luxAB são expressos, e os bioluminesces celular. Processamento da amostra não é necessário; o fago e são misturadas e, posteriormente, medido para a luz.

Protocolo

1. Y. pestis inoculação placa

1. Streak Y. pestis A1122 (BeiResources # NR15) em culturas de Luria-Bertani (LB) ágar (Miller). Use técnica estéril e executar todas as Y. manipulações pestis em um tipo II classe A biossegurança gabinete. Y. pestis A1122 é um Nível de Biossegurança (BSL) 2 estirpe agente excluídos selecionar. Falta-lhe tanto os 75 kb par de cálcio de baixa virulência de resposta (LCR) plasmídeo, eo locus pgm que são necessários para a virulência. Crescer Y. pestis a 28 ° C por 48 h em uma temperatura controlada de ar estática incubadora. A taxa de crescimento de Y. pestis é....

Discussão

Este método demonstra a capacidade do fago repórter para detectar rapidamente Y. pestis desde o fago repórter pode converter uma resposta de sinal bioluminescente para Y. cultivadas pestis células dentro de 20 min após a adição do fago. O fago repórter também é capaz de detectar diretamente Y. pestis em matrizes clínico, sem o pré-requisito de isolamento e cultivo de ⁷ subseqüente. Em comparação com os ensaios fago padrão de lise, que normalmente exige 48 h para a conclusão.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo
Difco agar LB, Miller	VWR	90003-346
Difco LB caldo, Miller	VWR	90003-350
17 x 100 mm tubos cultura	EUA Scientific	1485-0810
n-Decano	Sigma	D7384
Veritas luminômetro	Turner Biosystems	9100-001
Microlite de microtitulação de 96 poços da placa	VWR	62402-984