Um método rápido para a obtenção de leucócitos infiltrando a partir do cérebro de camundongos é descrito. Este método utiliza um gradiente de Percoll contínua e descontínua gradiente de Ficoll para selecionar e purificar a camada de leucócitos enriquecido. Leucócitos isolados podem então ser caracterizada por medidas de citometria de fluxo.
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Artigo de método
Isolamento de Brain-infiltrando Leucócitos
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Nós descrevemos um método para preparar leucócitos cérebro infiltrando (Bils) de camundongos. Demonstramos como para infectar ratos com encefalomielite murina de Theiler vírus (TMEV) através de uma técnica de injeção intracraniana e rápida como purificar uma população de leucócitos enriquecido de células infiltrando a partir do cérebro inteiro. Resumidamente, os ratos são anestesiados com isoflurano em uma câmara fechada e são free-hand injetado com uma seringa de Hamilton para o córtex frontal. Ratos são, então, matou em vários momentos após a infecção por overdose isoflurano e cérebros inteiros são extraídos e homogeneizados em RPMI com um moedor de tecido Tenbroeck. Homogeneizados de cérebro são centrifugação em um gradiente de Percoll contínua de 30% para remover os restos celulares de mielina e outros. A suspensão de células é então forçada a 40 mM, lavado e centrifugado em um descontínua gradiente de Ficoll-Paque Plus para selecionar e purificar os leucócitos. Os leucócitos são então lavadas e ressuspendidas em tampão apropriado para imunofenotipagem por citometria de fluxo. Citometria de fluxo revela uma população de células do sistema imunológico inato nas fases iniciais da infecção de camundongos C57BL / 6. Menos 24 horas após a infecção, subconjuntos múltiplas de células do sistema imunológico estão presentes no Bils, com uma população enriquecida de Gr1 +, CD11b + e + F4/80 células. Portanto, esse método é útil na caracterização da resposta imune à infecção aguda no cérebro.
Protocolo
1. Injeção intracraniana de vírus:
A técnica a seguir foi modificada e utilizada extensivamente por nosso laboratório e colegas. Resumidamente, a injeção intracraniana da estirpe de Daniel de murino Theiler de encefalomielite vírus (TMEV) ou sham-infecção (1, 10) é realizada em ratos jovens (de preferência 5-6 semanas de idade) para obter leucócitos cérebro infiltrando (Bils). Por favor, note que os resultados diferem entre estirpe de Daniel, a cepa feijão e da estirpe GDVII. Para efeitos de colheita Bils, ratos receber 2x10 5 UFP de TMEV e são infectadas por 24 horas.
- Coloque a agulha de injeção (calibre 27, em ¼, K....
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Discussão
Rotineiramente uso de citometria de fluxo para determinar a qualidade da preparação das células cerebrais se infiltrando, e para distinguir diferentes populações de células do sistema imunológico 2, 9. Aguda em tempo de pontos, o nosso método Bils rendimentos elevados percentuais de monócitos inflamatória dentro da população CD45hi, bem como altas porcentagens de macrófagos na população CD45lo. Isto indica que uma resposta imune reprodutíveis dentro do cérebro pode ser robustamente caracterizado por nosso mét.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado por bolsa NS64571 do NINDS (CLH), por um prêmio no início de desenvolvimento de carreira da Clínica Mayo (CLH), e por um generoso dom de Donald e Herdrich Frances (CLH). Gostaríamos de agradecer a Clínica Mayo Núcleo Citometria de Fluxo para obter assistência.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Reagente | Companhia | Número de catálogo | Comentários |
| TMEV | Howe Lab | N / A | |
| Estirpe de Daniel | Invitrogen | 21063-029 | |
| isoflurano | Novaplus | NDC 0409-3292-49 | |
| de fundo redondo de Oak tubos de centrífuga de Ridge | Nalgene | 3118-0030 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| PBS 10X | Roche | 11666789001 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Trypan Blue 0,4% (w / v) | Mediatech | 25-900-CI | |
| 15 ml tubos cônicos | BD Falcon | 352097 | |
| 7 mL de vidro Pyrex marca moedor de tecido Tenbroeck | Pescador | 08-414-10B | |
| 40 coador célula M | BD Falcon | 352340 | |
| 50 ml | BD Falcon | 352070 | |
| albumina de soro bovino | Sigma | A9647 | |
| azida de sódio | Sigma | S8032 | |
| CMF-PBS | Mediatech | 21-040-CV | |
| FACS tubos | BD Falcon | 352054 | |
| soro fetal bovino | Sigma | F4135 | |
| 2.4G2 hibridoma | ATCC | HB-197 | |
| Costar placa V-bottom | Corning | 3894 | |
| Allegra centrífuga X-22R ou equivalente | Beckman | N / A | |
| De 96 poços balde placa e rotor | Beckman | S2096 | |
| Rotor de ângulo fixo | Beckman | F0360 | |
| paraformaldeído | Sigma | P6148 | |
| BD FACS Calibur | BD Biosciences | N / A | |
| Programa FlowJo 7,5 | Árvore Star, Inc. | N / A | |
| CD45 | BD Biosciences | 557235 | clone: 30-F11 |
| Gr1 (Ly6C / G) | BD Biosciences | 553128 | clone: RB6-8C5 |
| CD11b | ebiosciences | 17-0112-83 | clone: M1/70 |
| F4/80 | ebiosciences | 17-4801-82 | clone: BM8 |
Referências
- Buenz, E. J., Howe, C. L. Picornaviruses and cell death. Trends Microbiol. 14, 28-36 (2006).
- Buenz, E. J., Limberg, P. J., Howe, C. L. A high-throughput 3-parameter flow cytometry-based cell death assay. Cytometry A. 71, 170-173 (2007).
- Deb, C., Lafrance-Corey, R. G., Zoecklein,....
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Reimpressões e permissões
