Numerosos estudos recentes identificaram mutações em proteínas sinápticas associada a patologias cerebrais. Primários cultivados neurônios corticais oferecem grande flexibilidade para examinar os efeitos destas proteínas doenças associadas na morfologia e motilidade espinha dendrítica.
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Artigo de método
Análise de Morfologia Spine dendríticas em neurônios cultivados CNS
Neste artigo
Resumo
Resumo
Espinhas dendríticas são os locais da maioria das conexões excitatórias no cérebro, e formam o compartimento pós-sináptico das sinapses. Estas estruturas são ricas em actina e tem se mostrado altamente dinâmico. Em resposta à plasticidade Hebbian clássica, bem como sinais de neuromoduladores, espinhas dendríticas pode mudar de forma e número, que é pensado para ser crítico para o refinamento dos circuitos neurais e processamento e armazenamento de informações dentro do cérebro. Dentro de espinhas dendríticas, uma complexa rede de proteínas ligação sinais extracelulares com o cyctoskeleton actina permitindo o controle da morfologia da coluna dendríticas e número. Estudos neuropatológicos demonstraram que um número de estados de doença, que vão desde a esquizofrenia para transtornos do espectro do autismo, exibir morfologia anormal da coluna dendríticas ou números. Além disso, estudos genéticos recentes identificaram mutações em genes que codificam várias proteínas sinápticas, levando a sugestões de que estas proteínas podem contribuir para a plasticidade da coluna aberrante que, em parte, estão na base da fisiopatologia desses transtornos. A fim de estudar o potencial papel destas proteínas no controle morfologias espinha dendrítica / número, o uso de culturas de neurônios corticais oferece várias vantagens. Em primeiro lugar, este sistema permite uma alta resolução de imagem das espinhas dendríticas em células fixo, assim como lapso de tempo imagens de células vivas. Em segundo lugar, este sistema in vitro permite a fácil manipulação da função da proteína pela expressão de proteínas mutantes, knockdown por construções shRNA, ou tratamentos farmacológicos. Estas técnicas permitem aos pesquisadores começam a dissecar o papel da doença proteínas associadas e prever como as mutações dessas proteínas podem funcionar in vivo.
Protocolo
O protocolo descrito aqui pode ser usado para examinar a morfologia espinha dendrítica e dinâmica de qualquer sistema primário de cultura.
1. Preparação de culturas primárias de neurônios corticais
- Prepare alta densidade culturas de neurônios corticais de ratos Sprague-Dawley E18 embriões e cultura em glia condicionado meio isento de soro 1-2.
- Euthanize um rato grávidas (E18) de acordo com procedimentos ACUC; remover rapidamente útero (com fetos na mesma) e coloque em um prato de Petri 100 milímetros no gelo.
- Corte útero aberto e membrana amniótica, segure feto pelo pescoço (cordão umbilical intac....
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Discussão
As técnicas descritas acima para a análise quantitativa detalhada da morfologia da coluna dendríticas, densidade linear e mobilidade em qualquer fixo ou ao vivo neurônios corticais primárias estão focadas na compreensão dos efeitos da pós-sinápticos mecanismos que podem contribuir para neuropatologias. Uma abordagem semelhante pode ser usado para quantificar a morfologia da coluna ou motilidade em qualquer neurônio spiny, incluindo piramidais do hipocampo, Purkinje, ou neurônios espinhosos médios.
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Divulgações
Produção deste trabalho foi suportado pelo Metamorph (dispositivos Molecular, Inc.).
Agradecimentos
Agradecemos a Kelly Jones para edição cuidadosa. Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder R01MH 071316, Associação de Alzheimer, a Aliança Nacional de Pesquisa em Esquizofrenia e Depressão (NARSAD), ea Aliança Nacional para a Pesquisa do Autismo (Naar) (PP); American Heart Fellowship Associação de Pós-Doutorado (DPS); americano coração Fellowship Association Predoctoral (KMW).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | Comentários (opcional) |
| 18 milímetros de vidro tampa redonda No. 1,5 | Warner Instruments | 64-0714 (CS-18R15) | |
| 22 milímetros quadrados tampa de vidro No. 1,5 | Warner Instruments | 64-0721 (CS-22S15) | |
| Poli-D-lisina | Sigma | P-0899 | MW 70 ~ 150 Kda |
| Mídia Neurobasal | Invitrogen | 21103049 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| Glutamina | Invitrogen | 21051024 | |
| Penicilina-estreptomicina | Invitrogen | 15140148 | |
| D, L-APV (AP-5) | Ascent Scientific | Asc-004 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| DMEM | Invitrogen | 11965092 | |
| HEPES | Mediatech Cellgro | 25-060-C 1 | 1M, pH 7 |
| Solução de formaldeído | Merck Química | FX0415-5 | 36%, Histologia grau |
| Cabras normais Serum | VWR | 100188-514 | Jackson Immunoresearch Labs |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | AC21568-2500 | Acros Organics |
| Alexa Fluor 488 cabra anti-camundongo IgG (H + L) altamente cross-adsorvido | Invitrogen | A-11029 | |
| Alexa Fluor 488 cabra anti-IgG de coelho (H + L) * altamente * cross-adsorvido | Invitrogen | A-11034 | |
| Prolongar reagente Antifade Ouro | Invitrogen | P36934 | Embalagens especiais |
| Câmara de estágio fechado imagem | Warner | RC-30HV | |
| Unidade de controlador de temperatura | Warner | TC-344B | |
| Metamorph | Universal Imagem |
Referências
- Banker, G., Goslin, K. Developments in neuronal cell culture. Nature. 336, 185-186 (1988).
- Xie, Z. Kalirin-7 controls activity-dependent structural and functional plasticity of dendritic spines. Neuron. 56, 640-656 (2007).
- Spear, L.
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Reimpressões e permissões
