Nós apresentamos um método para imunoprecipitação da cromatina do tecido da raiz dorsal após lesão axonal gânglios. A abordagem pode ser usada para identificar locais de transcrição específicos fator determinante e importante modificação epigenética de histonas e DNA para a regeneração de axônios lesados tanto no sistema nervoso periférico e central.
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Artigo de método
Cromatina imunoprecipitação de Tissue Dorsal Root Gânglios seguintes Lesão Axonal
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Axônios no sistema nervoso central (SNC) não se regeneram, enquanto as do sistema nervoso periférico (SNP) se regeneram de forma limitada após a lesão (Teng et al., 2006). Reconhece-se que os programas de transcrição essencial para crescimento de neuritos e axonal são reativados após lesão no PNS (Makwana et al., 2005). No entanto as ferramentas disponíveis para analisar regulação gênica neuronal in vivo são limitados e muitas vezes desafiador.
Os gânglios da raiz dorsal (DRG) oferecem um sistema excelente modelo prejuízo, porque tanto o CNS e PNS são inervados por um axônio bifurcada proveniente da soma mesma. Os gânglios representar uma coleção discreta de corpos celulares, onde todos os eventos ocorrem de transcrição, e assim fornecer uma região claramente definida de atividade transcricional que pode ser facilmente reproduzível e retirado do animal. Lesão de fibras nervosas no PNS (por exemplo, nervo ciático), onde a regeneração axonal ocorre, deve revelar um conjunto de programas de transcrição que são distintas das respondendo a uma lesão similar no sistema nervoso central, onde a regeneração não ocorre (por exemplo, na medula espinhal ). Sites para o fator de transcrição de ligação, histona e modificação de DNA resultante da lesão a qualquer PNS ou SNC podem ser caracterizadas usando cromatina imunoprecipitação (chip).
Aqui, nós descrevemos um protocolo chip usando tecido DRG fixo rato após lesão axonal. Esta poderosa combinação oferece um meio para caracterizar o ambiente cromatina pró-regeneração necessária para promover a regeneração axonal.
Protocolo
1. Lesão do nervo ciático e coluna dorsal
- O animal é colocado sobre uma toalha cirúrgica e debaixo dela um thermopad está presente em todo o processo de manter a temperatura corporal do rato a 37 ° C. Todos os animais são anestesiados para a cirurgia com uma contínua isoflurano / O 2 administração. Os instrumentos cirúrgicos são autoclavados antes do procedimento.
- De lesão ciática, ambos posteriores são cuidadosamente raspada, e depilação completa-se com removedor de pêlos genéricas antes limpeza da pele com álcool seguido por Betadyne 3 vezes.
- O nervo ciático é exposto por uma incisão 4 milímetros posterior e paralela ao fêm....
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Discussão
Este protocolo fornece um método para solicitar directamente sobre o meio ambiente cromatina durante a regeneração axonal no sistema nervoso adulto após lesão axonal. Ele incorpora o modelo de lesão DRG com imunoprecipitação da cromatina para sondar o ambiente de transcrição e epigenéticos após a lesão ou o PNS ou CNS. É particularmente útil para pesquisadores que gostariam de caracterizar suposta sítios de ligação para o seu fator de transcrição favorito, e para determinar se a ocupação destes locais ocorre em resposta.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer a Andrea Tedeschi para ajudar na definição das experiências ChIP inicial em laboratório e Lindner Ricco por sua contribuição para afinar as condições para ChIP. Este trabalho foi financiado pela Fundação Hertie, o Grant Fortune, Universidade de Tuebingen, ea DFG concede DI 1497/1-1 (todos concedida a Simone Di Giovanni).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Reagente | Companhia | Número de catálogo | |
| Tampão ChIP 10x | Sinalização celular | 7008 | |
| Tampão eluição 2x ChIP | Sinalização celular | 7009 | |
| ChIP Beads proteína G Grade Magnética | Sinalização celular | 9006 | |
| Rack Punho Magna (8 também) | Millipore | 2-40 | |
| Clorofórmio | MERCK | ONU 1888 | |
| O formaldeído 37% | ROTH | CP10.1 | |
| Solução Glycine 10x | Sinalização celular | 7005 | |
| Glicogênio | Sigma | G1767 | |
| HBSS 10x | Gibco | 14185 | |
| Anticorpo histona H3 (coelho) | Sinalização celular | 2650 | |
| Normais coelho IgG | Sinalização celular | 2729 | |
| Fenol / clorofórmio / álcool isoamílico | ROTH | A156.1 | |
| Cocktail de protease Comprimidos Inibidores | Roche | 04 693 116 001 | |
| Proteinase K (20 mg / ml) | Sinalização celular | 10012 | |
| SDS tampão de lise | Norte do estado | 20-163 |
| Equipamentos necessários |
|---|
| Sonicador |
| Micropistilo |
| Microcentrífuga |
| Thermomixer |
Referências
- Beirowski, B. Quantitative and qualitative analysis of Wallerian degeneration using restricted axonal labelling in YFP-H mice. Journal of Neuroscience Methods. 134, 23-35 (2004).
- Carey, M. F. Chromatin immunoprecipitation (ChIP). , Cold Spring Har....
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Reimpressões e permissões
