Relação custo-benefício Método de Rastreamento Fonte microbiana, utilizando específicas Vírus Humano e Animal

Summary

O estudo descreve um método de baixo custo para a identificação da fonte de contaminação fecal / urinária ou contaminação por nitratos na água usando qPCR para a quantificação específica de vírus de DNA humano / suínos / bovinos, adenovírus e polyomaviruses, propostos como ferramentas de MST.

Abstract

Contaminação microbiana do ambiente representa um risco significativo à saúde. Clássica bacteriana fecal indicadores têm mostrado ter limitações significativas, os vírus são mais resistentes aos processos de inativação muitos e padrão de indicadores de contaminação fecal não informar sobre a fonte de contaminação. O desenvolvimento da relação custo-eficácia dos métodos para a concentração de vírus a partir de água e ensaios moleculares facilita a aplicabilidade de vírus como indicadores de contaminação fecal e como fonte microbiana de rastreamento (MST) ferramentas. Adenovírus e vírus de DNA são polyomaviruses infectar espécies de vertebrados específicas, incluindo os seres humanos e são persistentemente excretados nas fezes e / ou urina em todas as áreas geográficas estudadas. Em estudos anteriores, sugerimos a quantificação do adenovírus humano (HAdV) e polyomaviruses JC (JCPyV) por PCR quantitativo (qPCR) como um índice de contaminação fecal humano. Recentemente, desenvolvemos ensaios qPCR para a quantificação específica de Poradenovírus cine (PAdV) e polyomaviruses bovina (BPyV) como animal de contaminação fecal marcadores com sensibilidades de cópias do genoma 1-10 por tubo de ensaio. Neste estudo, apresentamos o procedimento a ser seguido para identificar a fonte de contaminação em amostras de água utilizando essas ferramentas. Como exemplo de resultados representativos, análise de vírus em águas subterrâneas que apresentem níveis elevados de nitratos é mostrado.

Detecção de vírus em baixa ou moderada águas poluídas exige a concentração do vírus, pelo menos, vários litros de água em um volume muito menor, um procedimento que geralmente inclui duas etapas de concentração em série. Este procedimento um pouco pesado ea variabilidade observada em recuperações viral significativamente prejudicar o processamento simultâneo de um grande número de amostras de água.

A fim de eliminar o gargalo causado pelos procedimentos de duas etapas que temos aplicado um protocolo um passo desenvolvido em Studie anteriors e aplicável a uma diversidade de matrizes de água. O procedimento inclui: acidificação das amostras de dez litros de água, floculação por leite desnatado, sedimentação por gravidade dos materiais floculados, a coleta do precipitado e centrifugação, ressuspensão do precipitado em 10 ml de tampão fosfato. O concentrado viral é usado para a extração de ácidos nucléicos virais e os adenovírus específicas e polyomaviruses de interesse são quantificados por qPCR. Elevado número de amostras pode ser simultaneamente analisadas por este método de concentração de baixo custo.

O procedimento foi aplicado para a análise das águas balneares, água do mar e água do rio e, neste estudo, apresentamos os resultados da análise de amostras de águas subterrâneas. Este método de alto rendimento quantitativo é confiável, simples e rentável.

Protocol

1. Concentração de partículas virais presentes em amostras de água

1. Coleta e acondicionamento de amostras de água
   1. Coletar um mínimo de 2 repetições de 10 L por amostra em recipientes de plástico com fundo plano e uma amostra extra como um controle do processo. Esta última amostra será enriquecida com uma quantidade conhecida de partículas virais e usado como um controle.
      Nota: É recomendado ter material separado especiais (garrafas, tubos, etc) para amostras fortificadas.
   2. Verifique a calibragem dos conductimeter e recalibrar se necessário. Prepare um controle negativo usando água da torneira previamente ajustado para a condutividade ....

Discussion

O procedimento descrito iria cumprir as condições para um método de ajuste para a rotina dos laboratórios de saúde pública e ambiental: reprodutível, confiável, simples e rentável. O protocolo é simples, no entanto ele deve ser seguido com atenção. Baixa condutividade nas amostras sem adicionar a concentração de sais solicitado artificial de água do mar reduziria drasticamente a recuperação de vírus como seria o caso se o tempo de agitação de floculação é significativamente reduzido (menos de 5 horas por exemplo)........

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Centrífuga de alta velocidade (8.000 xg)	Berckman Coulter	Avanti J-20XP
medidor de pH termômetro, e conductimeter	Afora	LPPC3003
Tubos de plástico 100-200 cm de comprimento	Deltalab	350059
Estéril graduado pipetas descartáveis	Labclinics	PN10E1
Estéril de tubos de plástico de 1,5 e 10-15 mL (Eppendorf, Falcons, etc)	Afora	KA298/00
Potes de centrifugação (500 mL)	Fisher Scientific	SE5753512
Agitadores magnéticos e ímãs (um poramostra)	Fisher Scientific	10510
Vidro ou plástico recipientes, com fundos planos para permitir o uso de agitadores magnéticos	Deltalab	191642
A bomba peristáltica para a remoção do sobrenadante (ou uma bomba de vácuo jacto de água)	Watson-Marlow	323E / D
Temporizador para switch-off a agitação após 8-10 horas	Deltalab	900400
Ácido clorídrico (0,1 N e 1N)	Panreac	141020.1611
Hidróxido de sódio (1N)	Panreac	131687.1211
Sais do mar artificial de água do mar	Sigma	S9883
Leite desnatado (SM)	Difco	232100
Tampão fosfato pH 7, 5			1:2 v / v de estéril Na 2 HPO 4 0,2 M e NaH 2 PO 4 0,2 M em pH 7,5
Tiossulfato	Panreac	121879.1209	Fazer uma solução de 10% em água
QIAamp Viral RNA Mini Kit	Qiagen	52904
De 96 poços da placa de reacção óptica (500 unidades)	Applied Biosystems	43426659
Óptica cobre adesiva (100 unidades)	Applied Biosystems	4311971
TaqMan Ambiental PCR Master Mix 2x	Applied Biosystems	4396838